膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠Th1細胞及特異轉(zhuǎn)錄因子的動態(tài)變化

安　高　郭亞春　邢恩鴻　宋鴻儒　封桂英

(承德醫(yī)學(xué)院，河北　承德　067000)

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·基礎(chǔ)研究·

膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠Th1細胞及特異轉(zhuǎn)錄因子的動態(tài)變化

安高郭亞春邢恩鴻宋鴻儒封桂英

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000)

〔摘要〕目的研究雞Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠脾淋巴細胞Th1及其特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet動態(tài)變化，探討Th1細胞與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)進展的關(guān)系。方法108只DBA1/J小鼠隨機分為正常對照組(每組6只)和模型組(每組12只)，于初次免疫7、14、21 d、加強免疫后第7、21、35天無菌摘脾臟提取脾淋巴細胞，應(yīng)用流式細胞術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)檢測各組小鼠脾淋巴細胞Th1及其特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet變化情況。結(jié)果小鼠初免7 d和14 d模型組Th1細胞及其轉(zhuǎn)錄因子T-bet明顯高于正常組(P<0.01，P<0.05)，初免21 dTh1細胞及其轉(zhuǎn)錄因子T-bet與正常組無明顯區(qū)別(P>0.05)。加強免疫7 d模型組Th1細胞開始升高與正常組比較有顯著差異(P<0.01)，檢測其T-bet與正常組也有明顯區(qū)別(P<0.05)，加強免疫21 d模型組Th1細胞及T-bet表達量降低與正常組比較差異顯著(P<0.01，P<0.05)，加強免疫35 d模型組Th1細胞及T-bet表達量與正常組比較無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論CD4+Th1細胞及其特異轉(zhuǎn)錄因子動態(tài)變化可能和RA進展具有一定關(guān)系。

〔關(guān)鍵詞〕CIA;PCR;流式細胞術(shù)；Th1；T-bet

第一作者：安高(1987-)，男，碩士，主要從事中藥免疫學(xué)研究。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的發(fā)病機制中，較為公認的觀點為CD4+的Th1細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)啟動了RA的發(fā)生，抑制Th1細胞及細胞因子的分泌，可以抑制RA的發(fā)生和發(fā)展〔1，2〕。但在RA病程中，Th1細胞在整個病程中均起作用還是在某一特定階段起作用目前報道不一，絕大多數(shù)研究認為Th1細胞主要在RA發(fā)病的早期起作用〔3〕。本研究旨在觀察膠原蛋白誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠脾淋巴細胞Th1細胞及其特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet的動態(tài)變化。

1材料與方法

1.1實驗試劑及儀器PMA/Ionomycin mixture和BFA/Monensin mixture由Multisciences提供；抗鼠CD3PECy5、抗鼠CD4 FITC，抗鼠CD8PE、抗鼠IFN-γ PE、鼠IgG1 Isotype Contol PE及鼠IgG2 FITC均為eBioscience產(chǎn)品；雞Ⅱ型膠原產(chǎn)自Chondrex；CFA為Sigma產(chǎn)品；Trizol Reagent為Invitrogen產(chǎn)品；PrimeScript RT試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ由寶生物公司生產(chǎn)；FACSCalibur流式細胞儀為BD產(chǎn)品；自動脫水機及包埋機由Thermo生產(chǎn)。

1.2實驗動物雄性DBA1/J小鼠108只，7～8周齡〔上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號碼：SCXK(滬)2012-0002〕。

1.3方法

1.3.1建立CIA動物模型參考文獻〔4〕建立CIA動物模型。實驗動物CIA模型成模率在90%以上。

1.3.2關(guān)節(jié)癥狀評分參考文獻〔5〕，于小鼠初次免疫后28 d用AI指數(shù)判斷模型是否成功，AI指數(shù)越高，關(guān)節(jié)炎癥越重。

1.3.3動物分組及取材108只DBA1/J小鼠隨機分為對照組36只(每時間點6只)和模型組72只(每時間點12只)。無菌取部分脾臟提取淋巴細胞檢測Th1細胞，低溫下取部分脾臟分離淋巴細胞提取RNA，檢測Th1細胞特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet。

1.3.4流式細胞術(shù)檢測各時間點Th1細胞數(shù)量制備單個脾淋巴細胞，用臺酚藍計數(shù)活細胞數(shù)(應(yīng)在95%以上)，然后CD69染色檢測，確定淋巴細胞活化程度在90%以上。設(shè)對照管、檢測管1、檢測管2。每管加入CD4-FITC 1 μl室溫避光20 min。每管中加入100 μl固定液A，室溫避光15 min。洗滌，重懸細胞。每管中加入100 μl破膜及溶血液B，同時加入干擾素(IFN)-γ抗體。室溫避光15 min。洗滌，重懸細胞，上機檢測。

1.3.5熒光定量PCR檢測Th1細胞特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet常規(guī)提取各組小鼠脾臟淋巴細胞總RNA，按試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制備cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩-bet及內(nèi)參 GAPDH 的引物為T-bet(正義5′-AGCAAGGACGGCGAATGTT-3′，反義5′-GGGTGGACATATAAGCGGTTC-3′)、GAPDH(正義5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，反義5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′)。PCR反應(yīng)按試劑盒說明進行，T-bet退火溫度為57.5℃。按照 2-ΔΔCt法對基因表達進行相對定量分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17.0軟件行方差分析及t檢驗。

2結(jié)果

2.1小鼠的一般情況加強免疫后模型組小鼠精神萎靡，活動、飲食減少，體重逐漸減輕，在模型鼠免疫處的皮膚形成潰瘍，至加強后7 d，90%以上模型鼠AI指數(shù)在4分以上，模型鼠足墊增厚，足爪充血紅腫明顯；至加強免疫21 d，模型鼠足墊依然增厚，但足爪充血紅腫減輕；至加強免疫35 d，模型鼠足爪充血紅腫明顯減輕，足爪出現(xiàn)畸形;加強免疫前及正常組小鼠無上述改變。

2.2CIA小鼠脾指數(shù)變化免疫前各組小鼠脾指數(shù)無明顯差異，免疫后小鼠脾臟增大明顯，為暗紅色，初免后7 d至加強免疫21 d與正常組脾指數(shù)差異顯著(P<0.01)；至加強免疫后35 d，脾指數(shù)與正常組仍有明顯區(qū)別(P<0.05)，見表1。

2.3CIA小鼠Th1細胞及其特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet變化小鼠初免7 d和14 d，模型組Th1細胞明顯高于正常組(P<0.01)；初免21 d，Th1細胞與正常組無明顯區(qū)別。加強免疫7 d，模型組Th1細胞開始升高，與正常組比較有顯著差異(P<0.01)；加強免疫21 d，模型組Th1細胞降低，與正常組比較差異顯著(P<0.01)；加強免疫35 d，模型組Th1細胞與正常組比較無明顯差異，見表2。初次免疫7 d及14 d，與正常組比較，模型組T-bet表達量顯著增高(P<0.05)；至初免21 d，T-bet表達量開始下降，與正常組無明顯差異。加強免疫7 d，T-bet表達開始升高，與正常組有明顯差別(P<0.05)；加強免疫21 d，T-bet表達量有降低趨勢，與正常組比較有顯著差異(P<0.05)；到加強免疫35 d，T-bet表達量與正常組之間無明顯差異，見表3。

表1　小鼠脾指數(shù)動態(tài)變化

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

表2　Th1細胞的動態(tài)變化

表3　Th1細胞特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet的動態(tài)變化

3討論

RA是目前常見的自身免疫性疾病，但其確切發(fā)病機制尚不清楚。盡管很多研究證實，多種免疫細胞及其分泌細胞因子參與了關(guān)節(jié)炎癥的病理變化過程〔6〕。但絕大多數(shù)研究認為，Th1細胞介導(dǎo)的細胞免疫是RA發(fā)生的啟動因素，Th1細胞及其分泌的細胞因子的過量在RA發(fā)病機制中起著重要作用〔7〕。

Th1細胞主要分泌IFN-γ、白介素(IL)-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α，通過細胞因子發(fā)揮其免疫作用。有研究證明，CIA動物模型和RA患者外周血Th1細胞分泌的細胞因子水平增高〔4〕。其中TNF-α可以促進白細胞向關(guān)節(jié)腔浸潤，上調(diào)血管內(nèi)皮細胞黏附因子及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的分泌，導(dǎo)致RA滑膜組織特征性血管翳形成。另外，TNF-α也可以誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，引起滑膜成纖維細胞增生及骨及軟骨損害。有研究表明，阻斷TNF-α對RA患者可以起到較好的治療作用〔8～10〕。IFN-γ可以通過刺激單核巨噬細胞釋放TNF-α和IL-1等炎性細胞因子，間接地發(fā)揮促炎作用。研究RA患者滑膜組織中的T細胞發(fā)現(xiàn)主要是產(chǎn)生IFN-γ及 IL-2 的Th1細胞，而且RA關(guān)節(jié)液中IFN-γ及IFN-γ陽性細胞百分率增加，關(guān)節(jié)局部出現(xiàn)Th1細胞募集現(xiàn)象〔11，12〕。但也有研究表明，關(guān)節(jié)中Th1細胞的募集僅發(fā)生在早期RA患者，慢性RA患者IFN-γ也增多，但Th1細胞會逐漸減少，以Tp細胞為主，提示RA不同的病程階段CD4+T細胞亞群比例失調(diào)〔13〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠初免7 d和14 d模型組Th1細胞明顯升高，可能和機體接觸抗原刺激后應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。加強免疫7 d時，絕大多數(shù)小鼠的關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)紅腫，Th1細胞明顯升高，說明Th1細胞參與了CIA小鼠的關(guān)節(jié)病變。加強免疫21 d模型組小鼠紅腫開始消退，Th1細胞比正常組降低，說明此時可能存在CD4+T細胞平衡紊亂；至加強免疫35 d，模型組小鼠足爪紅腫明顯消退，出現(xiàn)畸形，Th1細胞開始升高接近于正常組，說明Th1細胞可能參與CIA小鼠軟骨及骨的破壞。本研究進一步應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)從分子水平驗證了Th1細胞在CIA鼠不同病程時期的變化情況。

綜上所述，通過研究RA發(fā)病過程中Th1細胞及其特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet動態(tài)變化特點，可能為評價RA的病情進展、預(yù)后及治療RA藥物的開發(fā)、篩選和機制探討提供合理的實驗依據(jù)。

4參考文獻

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4郭明，封桂英，郭亞春，等.Th1型細胞因子在膠原蛋白誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠血清中的動態(tài)變化〔J〕.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2014；30(3)：250-3.

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〔2014-12-23修回〕

(編輯李相軍)

The dynamic changes of Th1 cells and specific transcription factor of collagen-induced arthritis mice

AN Gao,GUO Ya-Chun,XING En-Hong,etal.

Chengde Medical College,Chengde 067000,Hebei,China

【Abstract】ObjectiveTo study the dynamic changes of Th1 cells and specific transcription factor T-bet in spleen of chicken type Ⅱ collagen induced arthritis(CIA) mice and to investigate the relationship between the development of rheumatoid arthritis(RA) and the changes of Th1 cells.Methods108 DBA1/J mice were randomly divided into control group(n=6) and CIA group (n=12).They were respectively picked the spleen and extracted the lymphocytes under the sterile condition on the initial immunization 7,14,21d and 7,21,35 d after booster immunization.Then the dynamic changes of Th1 cells were detected by flow cytometry and T-bet were detected by fluorescence quantitative PCR in different periods.ResultsTh1 cells and T-bet were significantly higher in CIA group than those in normal group at 7 d and 14 d after initial immunization(P<0.01,P<0.05),but there were no significant differences between CIA and normal groups at the 21 d after initial immunization(P>0.05).Th1 cells and T-bet began to increase at the 7 d after booster immunization and there were obvious differences between CIA and normal groups(P<0.01,P<0.05).While Th1 cells and T-bet began to significantly decrease,compared with those in normal group(P<0.01,P<0.05) at the 21 d after booster immunization.At the 35 d after booster immunization there were no significant differences between CIA and normal groups (P>0.05).ConclusionsThe dynamic changes of CD4+Th1 and specific transcription factor T-bet might have a relation with the progress of RA.

【Key words】CIA;PCR;Flowcytometry;Th1;T-bet

通訊作者：宋鴻儒(1961-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥免疫學(xué)研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81273986)

〔中圖分類號〕R593.22；R392.11

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6321-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.001