蛹蟲草抑制NF-κB p65表達對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

閆魏魏　蔡　琦　逄　利　徐大海　王少坤　張　楠　吳　揚

(吉林大學第一醫院急診內科，吉林　長春　130021)

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蛹蟲草抑制NF-κB p65表達對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

閆魏魏蔡琦逄利徐大海王少坤張楠吳揚

(吉林大學第一醫院急診內科，吉林長春130021)

〔摘要〕目的探討蛹蟲草通過抑制核轉錄因子p65(NF-κB p65)表達對腦缺血再灌注損傷的保護機制。方法健康成年大鼠分成正常對照組(C組)、缺血再灌注組(I/R組)、蛹蟲草低劑量治療組(250 mg/kg)、蛹蟲草高劑量治療組(500 mg/kg)，再灌注48 h后采用免疫印跡法測NF-κB p65蛋白表達水平，采用免疫組化檢測海馬組織中突觸素陽性細胞，蘇木素-伊紅染色(HE)法觀察大鼠海馬組織病理變化，酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測海馬組織中腫瘤壞死因子(TNF)-α和白介素(IL)-10含量。結果I/R組大鼠海馬組織損傷明顯，NF-κB p65蛋白、TNF-α的表達明顯增多，突觸素陽性細胞及IL-10表達明顯下降，與其他組比較差異顯著(P<0.05)，蛹蟲草高劑量治療組其NF-κB p65蛋白、TNF-α的表達均下降，而突觸素陽性細胞及IL-10表達明顯升高，與I/R組比較差異明顯(P<0.05)，與HE法觀察海馬組織結果相一致。結論蛹蟲草可抑制NF-κB p65表達的活化和表達，減輕腦缺血再灌注損傷。

〔關鍵詞〕蛹蟲草；核轉錄因子p65表達；腦缺血再灌注；腦保護

第一作者：閆魏魏(1989-)，男，碩士，主要從危重癥的治療研究。

蛹蟲草具有抗感染、抗氧化、抑制炎癥反應、清除自由基、增強免疫力、抗凋亡、抗疲勞等作用〔1〕。多種研究表明其具有清除自由基及抑制炎性介質釋放等作用。在腦缺血再灌注損傷后復雜的病理生理機制中，炎癥反應、氧自由基損傷是導致腦缺血再灌注后神經功能損傷的主要原因，是目前急危重癥醫學研究中的熱點，抗氧化應激損傷、減輕炎癥反應也成為治療缺血性腦血管疾病的重要途徑〔2～6〕。本研究旨在觀察蛹蟲草通過抑制核轉錄因子(NF-κB)p65的活化和表達，對腦缺血再灌注損傷的腦保護作用。

1材料與方法

1.1試驗動物和主要試劑健康成年雄性大鼠(吉林大學動物實驗中心)；酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海信然生物公司)；突觸素測定試劑盒(Nenmarkers公司)；NF-κB p65、Lamin抗體(上海通派科技)；蛹蟲草(吉林省蠶業科學研究所，60℃烘干、含水量<1.0%、磨粉過100目篩)。

1.2分組對照組(C組)：進行假手術操作，未使用線栓法建立腦缺血再灌注模型；缺血再灌注組(I/R組)：線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，給予等量生理鹽水灌胃；蛹蟲草低劑量治療組(L-cordyceps組)：線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，蛹蟲草溶液250 mg/kg灌胃；蛹蟲草高劑量治療組(H-cordyceps組)：線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，蛹蟲草溶液500 mg/kg灌胃。

1.3動物模型的建立除C組外，腦缺血再灌注大鼠模型均按制作方法〔7〕獲得，接受腦缺血2 h和再灌注48 h的處理。

1.4免疫印跡法用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉大鼠后，充分暴露大鼠心臟及主動脈弓并留置輸液針，將右心耳剪開，用生理鹽水快速灌洗后再用4%的多聚甲醛灌流內固定，直到流液透明，斷頭取腦，切取右側大腦半球距嗅球尖端7～11 mm，厚約2 mm的冠狀腦組織，將標本保存于液氮中。取液氮中保存的腦組織標本，于4℃解凍后稱重，每20 mg組織加入150～250 μl裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，充分裂解后，10 000～14 000 r/min離心3～5 min，取上清，測定蛋白的濃度，將40 μg等蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，濕轉至硝酸纖維素(NC)膜，經3%牛血清蛋白(BSA)封閉并搖床后3 h，加入1∶2 000稀釋的抗體，4℃過夜，用Washing Buffer洗膜3次，5 min/閃，再加入1∶10 000稀釋的堿性磷酸酶標記二抗后室溫搖床2 h，再次用Washing Buffer洗膜5次，3 min/次，然后用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽/硝基四氮唑藍(NBT/BCIP)顯色，結果用圖像處理儀處理并得出吸光度(A)值，目標蛋白的表達水平以“NF-κB p65/內參(β-actin)”的吸光度值比率計算。

1.5免疫組化新鮮海馬組織取出進行常規梯度酒精脫水、二甲苯透明、組織石蠟包埋，連續切片，厚度為5 μm，制成載玻片標本，切片常規脫蠟至水，高溫高壓抗原修復，山羊血清封閉37℃，30 min，一抗4℃過夜，二抗37℃，30 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，常規復染封片，在光鏡下觀察并用圖像分析儀檢測突觸素反應產物的光密度值，以代表突觸素的量。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色將海馬組織切片脫蠟至水，常規HE，透明，封片，于光鏡下觀察海馬組織結構。

1.7ELISA取新鮮海馬組織ELISA法檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-10的水平，嚴格按照說明書進行。

1.8統計學方法采用SPSS13.0軟件進行方差分析。

2結果

2.1免疫印跡法與C組(0.21±0.02)相比，I/R組NF-κB p65蛋白表達水平(0.56±0.10)顯著升高；蛹蟲草高、低劑量組可抑制腦缺血再灌注損傷導致的NF-κB p65蛋白表達水平，其中H-cordyceps組(0.31±0.05)與I/R組相比具有顯著差異(P<0.01)，而L-cordyceps組(0.50±0.15)與I/R組相比并無顯著差別(P=0.13)。見圖1。

2.2大鼠海馬CA1區突觸素陽性細胞的分布大鼠腦組織切片進行突觸素免疫組織化學染色，結果發現突觸素陽性細胞在各組海馬CA1區的錐體層和顆粒層均有分布，I/R組突觸素表達的陽性率(90±26)低于C組(232±14)(P<0.01)；H-cordyceps組(173±30)與I/R組相比差異顯著(P<0.01)，而L-cordyceps組(101±17)(P=0.10)與I/R組相比并無顯著差別(P>0.05)。見圖2。

圖1　各組NF-κB p65表達水平

圖2　各組中突觸素陽性細胞分布

2.3HE染色光鏡下觀察，C組大鼠海馬CA1區可見3～4層排列緊密的錐體細胞，結構較完整，胞體大且染色均一，細胞核大而圓，核仁清晰可見。I/R組海馬區可見變形腫脹的錐體細胞，細胞層次較C組明顯減少，細胞帶排列紊亂，細胞間隙增寬，可見脫失和膠質化現象，胞核深染且體積減小，結構不清，可見明顯呈多角形或三角形的核固縮現象，外周見星形膠質細胞聚集，其細胞核明顯腫大、淡染。H-cordyceps組海馬CA1區結構比較完整，可見3～4層排列整齊的錐體細胞，呈圓形，核仁清晰可見，細胞脫失和膠質化現象較模型組減少，膠質細胞增生明顯減輕。見圖3。

圖3　各組海馬組織HE染色

2.4ELISA 法測定海馬TNF-α和IL-10的含量I/R組大鼠腦組織勻漿中TNF-α含量(28.86±1.93)較C組(10.96±1.96)明顯增加；與I/R組比較，L-cordyceps組(25.44±2.94)可減少腦組織勻漿中的TNF-α含量，但無統計學意義(P>0.05)；而H-cordyceps組大鼠腦組織勻漿中的TNF-α的水平(25.46±1.17)顯著降低(P<0.05)。I/R組大鼠腦組織勻漿中IL-10含量(7.11±0.47)同C組(3.07±0.55)比較顯著增加；與I/R組比較，L-cordyceps組可升高腦組織內IL-10含量(6.76±0.86)，但無統計學意義(P>0.05)；H-cordyceps組可明顯升高腦組織內IL-10含量(8.84±0.53)(P<0.05)。

3討論

研究發現，腦缺血缺氧使神經細胞產生損傷是一個快速的級聯反應，包括許多重要環節，其中炎性損傷是腦缺血再灌注神經系統損傷的重要機制之一，炎性瀑布反應觸發后可以加劇腦損傷的發展。NF-κB是JAK/STAT信號的下游分子，參與控制DNA的轉錄和細胞對外源性刺激的應答反應，如應激、細胞因子、自由基、紫外線、過氧化脂質以及細菌和病毒感染等〔8〕。NF-κB p65的活化及移位可導致下游多種細胞因子如TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌，這些細胞因子參與了腦缺血損傷所導致的神經系統損傷，提示上述細胞因子可能成為減輕腦缺血再灌注后神經系統損傷的新靶點。

蛹蟲草是我國名貴中藥，具有很高的食用和藥用價值。本研究說明蛹蟲草對NF-κB表達具有阻斷作用，高劑量蛹蟲草可通過減少大腦組織中TNF-α的含量從而減輕腦缺血再灌注后的炎癥損傷，發揮對腦組織及神經功能的保護作用。而IL-10是重要的抗炎細胞因子，能抑制單核-巨噬細胞等的活性，降低細胞炎癥因子對平滑肌細胞增殖的刺激作用，導致細胞間黏附分子表達和活性的下調，從而抑制TNF-α和一氧化氮(NO)的表達〔9〕，抑制白細胞聚集發揮其抗感染效應以保護神經系統功能。本研究說明蛹蟲草具有抑制腦缺血再灌注后炎癥反應作用，這與大鼠海馬組織形態學變化及免疫組化結果相一致，顯示了蛹蟲草可抑制NF-κB p65的活化和表達，從而減輕腦缺血再灌注后神經系統的損傷。

4參考文獻

1馬艷，汪宇，康萬軍，等.蛹蟲草口服液對小鼠耐缺氧和抗疲勞作用〔J〕.中國藥師，2012；15(10)：1375-7.

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6Ashburner J，Friston KJ.Voxel-based morphometry the methods〔J〕.Neuroimage，2000；11(6 Pt 1)：805-21.

7Longa EZ，Weinstein PR，Calson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20(1)：84-91.

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〔2015-03-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：吳揚 (1960-)，女，教授，主要從事危重癥及中毒研究。

基金項目：吉林省科技發展計劃重點科技攻關項目(No.20130206063YY，20140204054YY)；長春市科技計劃社會發展項目(No.12SF47)

〔中圖分類號〕R743

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6333-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.006