高血壓大鼠血腦屏障緊密連接變化與腦白質病變的相關性

張　彥　崔　怡　董運芳

(河北醫科大學第三醫院，河北　石家莊　050011)

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高血壓大鼠血腦屏障緊密連接變化與腦白質病變的相關性

張彥崔怡1董運芳1

(河北醫科大學第三醫院，河北石家莊050011)

〔摘要〕目的探討高血壓大鼠血腦屏障緊密連接變化與腦白質病變的可能關系。方法取健康清潔級雄性Wistar大鼠60只，隨機分為假手術組、模型4、8、12、20、30 w組，每組10只。監測血壓，進行腦白質病變分級，電鏡下觀察白質區血腦屏障結構，免疫熒光法檢測腦組織白蛋白滲出情況，Loyez染色法觀察神經纖維變化。結果術后各模型周組大鼠血壓均明顯高于同期假手術組(P<0.05)；其中模型組大鼠術后4、8 w血壓與術前相比血壓明顯升高，而術后12、20、30 w血壓趨于平穩。模型組大鼠術后8 w起胼胝體病變逐漸加重，之后尾核、內囊、外囊受累病變明顯加重，術后20 w時胼胝體病變分級明顯高于之前(P<0.05)。模型12 w組25個毛細血管內皮細胞緊密連接中有7個連續性中斷，基底膜厚度增加；模型20 w組22個毛細血管內皮細胞緊密連接中有8個連續性破壞，細胞出現明顯腫脹，胞內出現空泡樣病變；模型30 w組19個毛細血管內皮細胞緊密連接中有10個出現中斷。模型20 w組大鼠胼胝體存在可吞噬白蛋白的膠質細胞；模型30 w組大鼠存在顆粒狀白蛋白滲出，分布于腦實質中，以胼胝體、尾核滲出最為明顯。假手術組和模型4 w組大鼠的Loyez神經纖維排列整齊；模型8 w組大鼠的Loyez神經纖維排列出現紊亂；模型12 w組可見空泡樣改變；模型20 w可見腦白質出現明顯疏松，神經纖維斷裂；模型30 w組腦白質疏松更為明顯。結論持續高血壓狀態會損傷血腦屏障的毛細血管內皮細胞緊密連接，進而使血漿白蛋白滲出，引起神經毒性，導致腦白質病變的發生。

〔關鍵詞〕高血壓性腦白質病變；血腦屏障

1河北醫科大學

第一作者：張彥(1970-)，女，主管護師，主要從事腦血管病教學護理及輔助治療研究。

據統計，健康老年人群中約有14.2%的人存在腦白質病變的趨勢〔1〕。高齡和高血壓均為腦白質病變重要的危險因素〔2〕，其中高血壓為可干預的影響因素。研究顯示，血腦屏障受損可能與腦白質病變有關，但其具體的作用機制尚不十分清楚〔3〕。本研究旨在探討高血壓引發的毛細血管內皮細胞緊密連接損傷與高血壓性腦白質病變的相關性。

1材料與方法

1.1實驗動物健康雄性清潔級Wistar大鼠60只，體重70～100 g，由廣西醫科大學醫學實驗動物中心提供，合格證號：桂檢字(2003)：第0005，嚴格按照《實驗動物倫理審查指南》進行。隨機分為假手術組、模型4、8、12、20、30 w組，每組10只。

1.2模型建立和血壓測量根據已定型的雙腎雙夾法復制易卒中型腎血管性高血壓大鼠；假手術組采取未鉗位夾腎動脈。在不同時間點使用BP-2000型大小鼠無創血壓計(上海玉研科學儀器有限公司)經尾動脈測定大鼠收縮壓。

1.3腦白質病變分級使用10%的水合氯醛麻醉大鼠，劑量為400 mg/kg，經左心室向主動脈插管，剪開右心房，迅速灌注150 ml生理鹽水，至右心房流出無血澄清液體后使用4%多聚甲醛300 ml聯合0.1 mmol/L 磷酸緩沖液固定腦組織，開顱將腦組織取出后固定1 h，梯度蔗糖溶液脫水；包埋后置于冷凍切片機切片并進行HE染色。置于光學顯微鏡下觀察腦白質病變情況，病變分級標準為0級：正常；Ⅰ級：神經纖維相互纏繞；Ⅱ級：有明顯空泡樣改變；Ⅲ級：髓鞘的神經纖維消失。

1.4毛細血管內皮細胞緊密連接觀察按照1.3的方法開顱取腦，取出腦白質胼胝體后立即放于固定液中。根據電鏡操作標準過程制作超薄切片、半薄切片，鈾鉛雙染后加速電壓90 kV條件下使用日立H-7650型透射電子顯微鏡觀察血腦屏障超微結構的變化情況。

1.5腦白質白蛋白滲出檢測采取間接免疫熒光法檢測，先于枸櫞酸中修復抗原，在室溫條件下于兔血清中孵育1.5 h。將血清吸干后滴加稀釋過的綿羊白蛋白抗體，置于4℃環境中孵育過夜。用0.1 mmol/L磷酸緩沖液洗凈后，滴加兔抗綿羊二抗，避光條件下孵育1 h，洗凈后使用抗熒光淬滅封片液進行封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6Loyez神經纖維染色將冰凍切片置于4%鐵明礬溶液1 d，蒸餾水洗5～10次，使用新配置碳酸鋰蘇木素染液浸染1 d，置于1%鹽水乙醇分化20 s，流動水清洗至返藍為止。梯度酒精脫水，二甲苯透明，封固后置于光學顯微鏡下觀察。

1.7統計學方法應用SPSS11.0軟件進行t檢驗和方差分析。

2結果

2.1易卒中型腎血管性高血壓大鼠血壓監測情況術前兩組大鼠血壓之間無差異(P>0.05)；術后4、8、12、20、30 w時模型組大鼠血壓均明顯高于同期假手術組大鼠血壓(P<0.05)；其中模型組大鼠術后4、8 w血壓與術前相比血壓明顯升高，而術后12、20、30 w血壓趨于平穩。見表1。

表1　易卒中型腎血管性高血壓大鼠不同時間點血壓變化情況±s,n=10,mmHg)

與假手術組比較：1)P<0.05；與同組術前比較：2)P<0.01

2.2腦白質病變分級情況模型組大鼠腦白質病變分級隨時間延長逐漸加重，術后4 w起模型組大鼠胼胝體、尾核、內囊、外囊開始出現輕微病變，術后8 w起胼胝體病變逐漸加重，之后尾核、內囊、外囊受累病變明顯加重，術后20 w時胼胝體病變分級明顯高于之前(P<0.05)。另外3個區域各時間點與之前相比均無明顯改變(P>0.05)。見表2。

表2　不同時間點腦白質病變分級情況±s,n=10)

與模型20 w組比較：1)P<0.05

2.3血腦屏障超微結構觀察假手術組大鼠毛細血管內皮細胞間吻合、連接完整，血管形態平滑。模型4 w組和8 w組相鄰內皮細胞緊密連接中連續且吻合緊密；模型12 w組25個毛細血管內皮細胞緊密連接中有7個連續性中斷，基底膜厚度增加；模型20 w組22個毛細血管內皮細胞緊密連接中有8個連續性破壞，細胞出現明顯腫脹，胞內出現空泡樣病變；模型30 w組19個毛細血管內皮細胞緊密連接中有10個出現中斷。

2.4腦白質白蛋白滲出檢測模型4、8、12 w組大鼠腦實質和血管周圍未發現有血漿白蛋白滲出；模型20 w組大鼠胼胝體存在可吞噬白蛋白的膠質細胞，血管附近存在增強的白蛋白熒光；模型30 w組大鼠存在顆粒狀白蛋白滲出，分布于腦實質中，以胼胝體、尾核滲出最為明顯，血管周圍白蛋白滲出少于之前。

2.5Loyez神經纖維染色結果假手術組和模型4 w組大鼠的Loyez神經纖維排列整齊；模型8 w組大鼠的Loyez神經纖維排列出現紊亂；模型12 w組可見空泡樣改變；模型20 w組可見腦白質出現明顯疏松，神經纖維斷裂；模型30 w組腦白質疏松更為明顯。見圖1。

圖1　神經纖維染色觀察(×200)

3討論

自發性高血壓易卒中大鼠模型來源較少，高昂的成本限制了其使用〔4〕。易卒中型腎血管性高血壓大鼠多用于腦中卒相關研究，但該模型也適用于腦白質病變的研究，首先建模過程與人體慢性高血壓性腦白質病變發的發病過程相似的較高，其次病理切片顯示病情發展過程中出現的腦白質疏松、神經纖維缺失等病理改變與腦白質病變的病理改變一致〔5〕。本次研究中胼胝體為模型組大鼠病變最顯著的部位，與雙側頸動脈狹窄模型一致，原因主要為胼胝體供血的血管來源于豆紋動脈終末支，同源自大腦表面的血管間吻合度較差，當出現低灌注時胼胝體易出現缺血性改變。腦白質病變發病中高血壓和高齡為兩個主要的危險因素。高血壓患者的腦血管阻力提升、血管自動調節能力降低與腦白質病變的嚴重程度密切相關〔6〕。本研究結果支持高血壓與腦白質病變存在明顯關聯，能夠促進其發生、發展。血腦屏障對腦內的微環境起到嚴格調控作用。血腦屏障受損后，細胞因子、蛋白等大分子物質進入血管鼻、血管間隙、腦組織中引發功能性損害，可能為腦蛋白病變的發病機制〔7〕。本研究進一步支持了血腦屏障損傷在腦白質病變過程中發揮一定作用。該作用可能為血腦屏障受損時血漿中的大分子物質滲入腦組織，產生神經纖維毒性，引發腦白質病變。

4參考文獻

1常馨,霍世會,李曉蕓,等.老年腦白質病變患者認知障礙特點及危險因素〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(17):4324-5.

2Jalal FY,Yang Y,Thompson J,etal.Myelin loss associated with neuroinflammation in hypertensive rats〔J〕.Stroke,2012;43(4):1115-22.

3Kim CK,Lee SH,Kim BJ,etal.Age-independent association of pulse pressure with cerebral white matter lesions in asymptomatic elderly individuals〔J〕.J Hypertens,2011;29(2):325-9.

4Fujita Y,Lin JX,Takahashi R,etal.Cilostazol alleviates cerebral small-vessel pathology and white-matter lesions in stroke prone spontaneously hypertensive rats〔J〕.Brain Res,2008;1203(2):170-6.

5楊嫻,藍琳芳,邢世會,等.血腦屏障緊密連接損壞引起大鼠高血壓性腦白質病變〔J〕.中國神經精神疾病雜志,2013;39(2):82-7.

6張友平,劉開顏,蔡璇,等.91例缺血性腦白質病變患者的危險因素分析〔J〕.神經損傷與功能重建,2014;9(6):472-4.

7Chida Y,Kokubo Y,Sato S,etal.The alterations of oligodendrocyte,myelin in corpus callosum,and cognitive dysfunction following chronic cerebral ischemia in rats〔J〕.Brain Res,2011;1414(1):22-31.

〔2015-04-19修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項目：國家科學基金資助項目(No.00812736)；河北省自然科學基金資助項目(No.p013206147)；河北省科技攻關計劃課題資助項目(No.07278101D-7)

〔中圖分類號〕R743.2

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6335-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.007