人膠質細胞源性神經營養因子轉染大鼠神經干細胞移植對老年帕金森病大鼠的作用

楊曉帆　韓鵬飛　臧兆萍　陳　培

(牡丹江醫學院紅旗醫院神經內科，黑龍江　牡丹江　157011)

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人膠質細胞源性神經營養因子轉染大鼠神經干細胞移植對老年帕金森病大鼠的作用

楊曉帆韓鵬飛1臧兆萍2陳培3

(牡丹江醫學院紅旗醫院神經內科，黑龍江牡丹江157011)

〔摘要〕目的探討人膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)轉染大鼠神經干細胞移植對老年帕金森病(PD)大鼠的作用。方法SD大鼠分為重組GDNF腺病毒(Ad-GDNF)組、LacZ 腺病毒(Ad-LacZ)組和磷酸緩沖液(PBS)組。將重組腺病毒及PBS定向注射至一側黑質附近,1 w后于同側紋狀體注射6-羥基多巴胺(OHDA)誘發多巴胺(DA)能神經元進行變性。通過旋轉行為觀察和中腦酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化染色及紋狀體單胺類遞質高壓液相色譜-電化學儀(HPLC-ECD)檢測評估其治療效應;通過RT-PCR、ELISA檢測Ad-GDNF 腦內表達情況。結果Ad-GDNF組大鼠的平均旋轉次數顯著少于Ad-LacZ組和PBS組(P<0.05)，損毀側/損毀對側黑質的TH陽性細胞百分比顯著高于Ad-LacZ組和PBS組(P<0.05)，DA、高香草酸(HAV)、3，4二羥基苯乙酸(DOPAC)損毀側/損毀對側百分比均顯著高于Ad-LacZ組和PBS組(P<0.05)，病毒注射后5 w的GDNF含量顯著高于Ad-LacZ 對照組和PBS對照組(P<0.05)，病毒注射后9 w的GDNF含量顯著高于Ad-LacZ 對照組(P<0.05)。結論人GDNF轉染大鼠神經干細胞移植對老年PD大鼠具有一定的保護作用。

〔關鍵詞〕人膠質細胞源性神經營養因子；神經干細胞移植；帕金森病

1牡丹江醫學院紅旗醫院檢驗科

2齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院神經內科

3牡丹江醫學院病理生理教研室

第一作者：楊曉帆(1982-)，男，碩士，主治醫師，主要從事腦老化與腦血管病研究。

膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)作為一種新型強效的多巴胺(DA)能神經元神經營養因子被認為是一種潛在的帕金森病(PD)保護性治療藥物,研究〔1〕顯示將GDNF 蛋白直接注射到多種PD 動物模型黑質或紋狀體,均可有效阻止DA 能神經元變性丟失。GDNF 臨床應用的主要障礙是給藥不便,因其不易透過血腦屏障。利用基因轉移技術使其在病變區直接表達是克服這一問題的重要發展方向。本實驗利用偏側PD 大鼠模型探討腺病毒介導的GDNF 基因直接轉移對PD 的保護性治療作用。

1材料與方法

1.1一般材料LacZ腺病毒(Ad-LacZ)、重組GDNF腺病毒(Ad-GDNF)由美國密歇根大學提供，6-酪氨酸羥化酶(TH)單抗、羥基多巴胺(6-OHDA)由美國Sigma 公司生產，酶標EnVision 二抗是美國DaKo公司產品，X-gal是華美公司生產，GDNF ELISA試劑盒是美國Promega 公司生產，RNA 提取試劑Trizol是美國Gibco生產，RT-PCR試劑盒是日本TaKaRa 公司生產，PCR 引物是上海生工公司生產，SD大鼠由中英合資上海西普爾BK 實驗動物有限公司提供。人GDNF和大鼠β-actin引物序列及擴增片段長度見表1。

1.2分組70只SD大鼠均為雄性，月齡為6個月，體重200～250 g，平均(225±25)g。隨機分為Ad-GDNF組26只、Ad-LacZ組26只、磷酸緩沖液(PBS)組18只。

表1　人GDNF和大鼠β-actin引物序列及擴增片段長度

1.3腺病毒和PBS黑質定向注射向右側黑質附近注射腺病毒或PBS，注射過程中嚴格依據下列坐標：前囟后、中線旁開、顱骨下分別為5.3、1.9、7.5 mm。在PBS中懸浮Ad-GDNF和Ad-LacZ，給予Ad-GDNF組1 μl/min的速度注射6×109顆粒(3 μl,1.2×107噬斑)病毒，給予Ad-LacZ組1 μl/min的速度注射1×107顆粒(3 μl,7.5×106噬斑)病毒，給予PBS組1 μl/min的速度注射等體積PBS。完成注射后進行10 min的留針后以較慢的速度退出〔1,2〕。

1.46-OHDA紋狀體立體定向注射定向注射腺病毒或PBS 1 w后向右側紋狀體注射4 μg/μl的4 μl 6-OHDA，注射過程中分4點，并嚴格依據下列坐標：前囟前、中線旁開、顱骨下分別為1.2 mm和1.2 mm，2.5 mm和3.5 mm，4.5、6.5 mm和4.5、6.5 mm。每點的注射速度和注射量均分別為1 μl/min和1 μl。完成注射留針5 min后以較慢的速度退出〔3,4〕。

1.5旋轉行為觀察完成注射6-OHDA后2 w和6 w給予大鼠腹腔注射0.25 mg/kg阿撲嗎啡，以對其旋轉進行誘發，觀察旋轉行為變化〔5，6〕。

1.6TH免疫組化檢測腺病毒感染7 w后3組各取10只大鼠，給予升主動脈灌注200 ml pH值為7.2的4%多聚甲醛固定，取中腦進行TH免疫組化，觀察中腦多巴胺(DA)能神經元損毀情況。將每只大鼠腺病毒或PBS注射點附近的中腦中部的5個切片斷面取出，計數兩側黑質TH陽性細胞數，計算損毀側和對側黑質TH陽性細胞數百分比〔7,8〕。

1.7高壓液相色譜-電化學(HPLC-ECD)檢測紋狀體單胺類遞質取出病毒感染后5、7、9 w三組大鼠的雙側紋狀體，分別有6只、6只、4只，運用HPLC-ECD檢測DA、高香草酸(HVA)、3,4二羥基苯乙酸(DOPAC)、5-羥吲哚乙酸(HIAA)、5-羥色胺(HT)含量〔9,10〕。

1.8外源性基因表達檢測病毒感染后6 w取中腦組織，運用RT-PCR檢測GDNF表達，運用X-gal化學染色法檢測LacZ基因表達。此外，病毒感染后5、9 w分別取出大鼠右側中腦腹側1/3組織，各6只，稱重，加入裂解液過程中嚴格依據200 μl/10 mg腦組織，NaCl、Tris(pH7.6)、PMSF、Leupeptin、Glycerol、NP-401分別為137 mmol/L、20 mmol/L、1 mmol/L、1 μg/ml、10%、1%，充分研磨成勻漿，4℃離心15 min，12 000 r/min。取上清，同等條件下再離心10 min。取上清，運用ELISA法檢測GDNF，上樣過程中每個標本做1∶2、1∶4、1∶8、1∶16系列稀釋度〔11,12〕。

1.9統計學方法應用SPSS20.0統計軟件進行t檢驗。

2結果

2.1三組旋轉行為比較Ad-GDNF 組平均旋轉次數〔(5.4±15.2)次〕顯著少于Ad-LacZ組和PBS組〔(30.0±27.7)次、(40.8±25.0)次〕(P<0.05)。

2.2三組兩側黑質的TH陽性細胞計數比較Ad-GDNF 組損毀側TH陽性細胞計數、損毀側/損毀對側黑質TH陽性細胞百分比顯著高于Ad-LacZ組和PBS組(P<0.05)，見表2。

表2　三組兩側黑質的TH陽性細胞計數比較±s)

與Ad-LacZ組比較：1)P<0.05；與PBS組比較：2)P<0.05；下表同

2.3三組紋狀體單胺類遞質檢測結果比較Ad-GDNF 組DA、HAV、DOPAC損毀側/損毀對側百分比均顯著高于Ad-LacZ組和PBS組(P<0.05)，見表3。

2.4三組外源性基因表達檢測結果比較Ad-GDNF 組病毒注射后5 w的GDNF含量顯著高于Ad-LacZ組和PBS組(P<0.05)，病毒注射后9 w的GDNF含量顯著高于Ad-LacZ組(P<0.05)，見表4。

表3　三組紋狀體單胺類遞質檢測結果比較±s)

表4　三組外源性基因表達檢測結果比較±s)

3討論

就神經變性疾病而言,神經保護性治療指那些通過影響病因及發病機制而帶來長期益處的干預措施,它應當能推遲發病或延緩病情的發展。盡管PD 確切病因未明,而且也未發現與GDNF缺乏有關,但有資料〔9〕提示GDNF 不僅對DA 能神經元正常發育和功能具有促進作用,同時對6-OHDA、1-甲基-4-苯基-1 ,2 ,3 ,6-四氫吡啶(MPTP)、甲基安非他敏等神經毒造成的DA 能神經元損傷具有保護和修復作用,而這些神經毒的毒性作用機制與PD 發病機制有很多共同之處。因此,利用6-OHDA 誘發的PD動物模型來研究GDNF 基因轉移對PD 的保護性治療作用有其一定的合理性。本研究結果充分說明人GDNF轉染大鼠神經干細胞移植對老年PD大鼠具有一定的保護作用。

4參考文獻

1陳波，高小青，楊朝鮮，等.移植GDNF基因修飾的神經干細胞對大鼠腦卒中的神經保護作用〔J〕.解剖學雜志，2009;32(3)：286-90.

2智春升，謝林.骨髓基質干細胞移植對大鼠脊髓損傷后BDNF與GAP-43基因表達的影響〔J〕.中國矯形外科雜志，2009;17(18)：1404-6.

3彭玉，游輝，張其梅，等.骨髓基質干細胞移植對腦梗死大鼠生長相關蛋白-43表達得影響〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2008;12(51)：10085-9.

4馬學玲，王心蕊，江新梅，等.骨髓間充質干細胞定向移植局灶性腦缺血大鼠行為學變化〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2008;12(3)：578-82.

5阮成鈞，張化彪，馮偉生，等.細胞移植對腦出血腦損傷的保護作用〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2008;12(36)：7551-4.

6李曉霞，何志義.靜脈注射骨髓基質細胞后局灶性腦缺血大鼠膠質細胞源性神經營養因子的表達〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2008;12(21)：4107-10.

7翁金森，劉楠，杜厚偉，等.骨髓間充質干細胞移植對腦梗塞大鼠神經功能恢復及突出素表達得影響〔J〕.細胞與分子免疫學雜志，2008;24(1)：34-7.

8李紅玲,葛艷萍,郭艷蘇,等.實驗性腦出血血腫周圍組織細胞凋亡的研究〔J〕.中國康復理論與實踐,2008;14(3):206-9.

9王運良,包仕堯,謝鵬,等.膠質細胞源性神經營養因子對腦出血大鼠神經功能的保護作用〔J〕.中國臨床康復,2005;9(1):95-7.

10王飛,潘慶剛,鄧東風,等.膠質細胞源性神經營養因子基因修飾的神經干細胞移植治療大鼠腦損傷〔J〕.中華創傷雜志,2007;23(12):894-7.

11霍麗濤,黃星會,吳慶文.帕金森病患者嗅覺障礙的相關影響因素〔J〕.中國老年學雜志,2014;34(23):6580-1.

12董寧,陳秋惠,張穎,等.帕金森病相關惡性綜合征的研究進展〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(14):3527-8.

〔2014-05-29修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者：陳培(1981-)，女，碩士，講師，主要從事腦老化與腦血管病研究。

基金項目：黑龍江教育廳科學技術研究項目(No.12531734)

〔中圖分類號〕R743.3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6339-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.009