己酮可可堿對老年雄性大鼠梗死心肌的保護作用及機制

簡立國　李小威　丁同斌　劉士超

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科,河南　鄭州　450014)

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己酮可可堿對老年雄性大鼠梗死心肌的保護作用及機制

簡立國李小威丁同斌劉士超

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科,河南鄭州450014)

〔摘要〕目的觀察己酮可可堿對老年雄性大鼠心肌梗死后梗死面積、心功能及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9蛋白在心肌中表達(dá)的影響。方法45只老年雄性Wistar大鼠，隨機分為假手術(shù)組、模型組、治療組，每組15只。假手術(shù)組,開胸暴露心臟，只穿線而不結(jié)扎左冠狀動脈前降支，模型組和治療組分別結(jié)扎左冠狀動脈前降支。治療組術(shù)后即刻及術(shù)后每天腹腔注射己酮可可堿，假手術(shù)組和模型組注射等劑量生理鹽水。術(shù)后7 d分別取材，進(jìn)行心肌梗死面積測定、通過小動物多道生理記錄儀和超聲心動圖檢測心功能、免疫組化法觀察MMP-9的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果治療組心肌梗死面積縮小、心功能改善明顯；與假手術(shù)組相比，模型組和治療組MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高；治療組MMP-9蛋白表達(dá)水平低于模型組。結(jié)論己酮可可堿對老年大鼠缺血心肌具有保護作用，其機制可能是減少MMP-9蛋白的表達(dá)。

〔關(guān)鍵詞〕己酮可可堿；心肌梗死；基質(zhì)金屬蛋白-9

第一作者：簡立國(1971-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事心血管疾病基礎(chǔ)與介入治療研究。

急性心肌梗死(AMI)是臨床常見的急危重疾病，其中炎癥反應(yīng)在其發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色，腫瘤壞死因子(TNF)-α是炎癥反應(yīng)中的重要始動因子。研究表明TNF-α可激活c-Jun和c-fos基因，后者與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9啟動子區(qū)的活化蛋白(AP)-1結(jié)合，導(dǎo)致MMP-9激活〔1〕，MMP-9參與心肌缺血、心肌重塑、心力衰竭等多種心血管疾病的病理生理過程〔2〕，己酮可可堿是一種能夠抑制TNF-α轉(zhuǎn)錄和翻譯的黃嘌呤衍生藥物。基于上述報道，筆者提出如下假設(shè)，己酮可可堿對缺血心肌有保護作用，其機制可能為抑制MMP-9蛋白的表達(dá)，從而減少心肌重塑、心肌壞死。本實驗通過觀察己酮可可堿對老年大鼠心肌梗死后梗死面積、心功能及MMP-9蛋白在心肌中表達(dá)水平的作用，探討其心肌保護機制。

1材料與方法

1.1藥物、主要試劑及實驗器材己酮可可堿注射液(石家莊第一制藥廠)，MMP-9兔Ig-G單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，SP免疫組化試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)，Biopac多道生理記錄儀(美國BIOPAC公司)，GE VIVID7超聲診斷儀(美國GE公司)，小動物呼吸機(江西特力麻醉呼吸設(shè)備公司)，顯微鏡(奧林巴斯公司)，MFLLab200心功能軟件記錄儀。

1.2動物造模及分組老年雄性Wistar大鼠45只(鄭州大學(xué)動物中心提供，合格證號：410116)，體重(510±35)g，平均月齡(18±0.2)個月，隨機分為假手術(shù)組(開胸，只穿針而不結(jié)扎左冠狀動脈前降支)、模型組、治療組，每組15只；參考文獻(xiàn)〔3〕方法，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的水合氯醛腹腔麻醉后，常規(guī)背位固定，連接多通道生理信號采集處理系統(tǒng)，氣管插管后連接呼吸機。左前胸常規(guī)備皮、消毒，心搏最明顯處剪開皮膚開胸暴露心臟，切開心包，在動脈圓錐與左心耳之間下約1 mm處用線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，觀測前壁心肌組織顏色由鮮紅迅速變?yōu)榘导t，隨后逐漸變?yōu)榘咨碾妶D監(jiān)測Ⅰ和avL導(dǎo)聯(lián)ST段較前上抬>0.2 mV提示手術(shù)成功。心臟重置于胸腔，分層縫合胸壁。治療組術(shù)后即刻及術(shù)后每天腹腔注射己酮可可堿(200 mg/kg)，假手術(shù)組和模型組注射等劑量生理鹽水。

1.3超聲心動圖檢測心功能術(shù)后7 d對各組大鼠進(jìn)行心功能檢查，選取一幅標(biāo)準(zhǔn)心尖四腔切面，進(jìn)入Simpson法研究模式，測量左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)，計算出射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)，各指標(biāo)均測量2次，取平均值。

1.4血流動力學(xué)測定術(shù)后7 d，10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠。麻醉成功后分離右側(cè)頸總動脈，插入測壓導(dǎo)管，連接Biopac多通道生理記錄儀，將導(dǎo)管插入左心室，記錄左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室收縮末壓(LVSP)、左心室上升下降最大速率(±dp/dtmax)。

1.5梗死面積測定術(shù)后7 d處死大鼠，40%甲醛灌流固定后取出心臟，沿左室短軸橫切片，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片、HE染色光鏡下觀察，IMS圖像分析系統(tǒng)檢測心肌梗死面積和左室心肌面積，梗死面積百分比(%)用心肌梗死面積/左室面積×100%表示。

1.6心肌免疫組織化學(xué)染色術(shù)后7 d大鼠心肌MMP-9的檢測采用SP二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，具體步驟按試劑盒說明書操作。抗體稀釋濃度1∶100，陰性對照用PBS替代一抗。每張切片任選5個視野，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、間質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，且其著色強度高于背景非特異性染色者判定為陽性。免疫組化染色的半定量判定：①蛋白染色指數(shù)，染色強度：無色、淡黃、棕黃、棕褐分別為0、1、2、3分；染色廣度：陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比；免疫組化染色指數(shù)為染色強度與染色廣度乘積，指數(shù)越高，蛋白表達(dá)越多。②采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖片處理，用積分光密度(IOD)表示MMP-9蛋白的表達(dá)，IOD=面積密度×平均光密度，IOD數(shù)值越大，表示蛋白表達(dá)越強。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。

2結(jié)果

2.1己酮可可堿對老年大鼠超聲心動圖心功能結(jié)果的影響心肌梗死后LVEDD及LVESD較假手術(shù)組顯著增加，而EF及FS則顯著降低，與模型組比較治療組LVEDD及LVESD顯著降低，而EF及FS則顯著升高，見表1。

2.2己酮可可堿對心肌梗死大鼠血流動力學(xué)影響心肌梗死后LVSP及LVEDP顯著升高，±dp/dtmax顯著降低；與模型組相比，治療組LVSP升高明顯，提示己酮可可堿能增強心肌收縮，而LVEDP升高及±dp/dtmax顯著降低則提示己酮可可堿能增加心肌舒張功能，見表2。

2.3己酮可可堿對大鼠梗死面積的影響治療組心肌梗死面積較模型組顯著減少，說明己酮可可堿能夠縮小心肌梗死范圍。見表2。

表1　各組大鼠超聲心動圖心功能檢查結(jié)果

與假手術(shù)組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05，下表同

表2　各組大鼠有創(chuàng)血流動力學(xué)及梗死

2.4己酮可可堿對梗死大鼠心肌MMP-9蛋白表達(dá)的影響應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色顯示，與假手術(shù)組〔(0.132±0.008)〕比較，MMP-9表達(dá)量在模型組細(xì)胞質(zhì)明顯升高可見大量強陽性棕褐色顆粒〔(0.537±0.012)，P<0.05〕，而假手術(shù)組MMP-9表達(dá)量極低，幾乎見不到棕褐色顆粒。與模型組比較，治療組MMP-9表達(dá)量顯著減少〔(0.408±0.009)，P<0.05〕，見圖1。

圖1　已酮可可堿對梗死心肌組織MMP-9蛋白表達(dá)的影響(SP，×400)

3討論

AMI是冠狀動脈急性、持續(xù)缺血缺氧所引起的心肌壞死，是一種心血管急危重病，臨床預(yù)后與心肌梗死范圍及時間密切相關(guān)，其中以左前降支閉塞導(dǎo)致的心梗后左心室衰竭預(yù)后最差，因此如何減少心梗后心衰成為目前醫(yī)學(xué)研究熱點。Irwin等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死后大鼠心肌TNF-α mRNA表達(dá)量明顯增加，同時TNF-α與心肌缺血嚴(yán)重程度有關(guān)。臨床研究表明己酮可可堿可改善心力衰竭患者的NYHA分級和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)〔5〕。不論缺血性還是非缺血性心肌病患者，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)和β受體阻斷劑是否達(dá)到最優(yōu)化治療，不同NYHA心功能分級的心力衰竭患者均可從己酮可可堿治療中獲益。本研究發(fā)現(xiàn)，己酮可可堿可逆轉(zhuǎn)心肌缺血引起的血流動力學(xué)改變，改善左室功能。

心力衰竭是各種心臟病的終末階段，其病理生理機制主要是神經(jīng)內(nèi)分泌的激活和心室重構(gòu)，其中心室重構(gòu)重要環(huán)節(jié)是心肌細(xì)胞的重塑和心肌細(xì)胞外基質(zhì)的變化。由基底膜蛋白、纖維膠原、糖胺聚糖和蛋白多糖等組成的心肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)對維持心臟形狀和功能起重要作用，MMPs能降解ECM，MMP-9又稱明膠酶B，是MMPs家族重要成員之一，與多種心血管疾病密切相關(guān)。心力衰竭時，MMP-9被激活，膠原結(jié)構(gòu)遭到破壞進(jìn)而導(dǎo)致心肌間連接趨于松散，在室壁壓力的作用下，左心室構(gòu)形出現(xiàn)變化，進(jìn)而導(dǎo)致室壁抗張力作用明顯下降，加重左室形態(tài)和大小的改變，進(jìn)而影響左心室功能，由此看出，MMP-9在心室重構(gòu)中扮演重要角色。研究表明，利用MMP-9抑制劑可延緩慢性心力衰竭犬左心功能障礙和重構(gòu)的發(fā)生〔6〕。Yan等〔7〕研究184例EF<40%的患者，發(fā)現(xiàn)血漿MMP-9升高與EF降低，LVEDD增加及左室功能下降有良好的相關(guān)性，因此降低MMP-9表達(dá)水平可改善左心功能。本研究發(fā)現(xiàn)，己酮可可堿可改善心肌梗死后大鼠左心功能，可能與其減少大鼠心肌MMP-9蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。

易損斑塊的纖維帽破裂和局部血栓形成是心肌梗死的主要發(fā)病機制。研究表明MMP-9在降解ECM、使斑塊纖維帽崩解及隨后的斑塊破裂起重要作用〔8〕。Manginas等〔9〕發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者外周靜脈血MMP-9水平明顯升高，且與肌鈣蛋白I存在相關(guān)性。Fiotti等〔10〕通過收集支架植入術(shù)中患者遠(yuǎn)端保護裝置中的碎屑發(fā)現(xiàn)，MMP-9在急性冠脈綜合征組的表達(dá)高于穩(wěn)定型心絞痛組。因此MMP-9除了與心肌梗死直接相關(guān)外，還能反應(yīng)疾病嚴(yán)重程度。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后大鼠心肌中MMP-9蛋白表達(dá)增加，這與上述報道一致，己酮可可堿可減少心梗面積，可能與其降低MMP-9蛋白的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，己酮可可堿對老年大鼠心肌缺血有保護作用，同時可改善心肌梗死后左心功能，這可能與其抑制MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)。

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〔2015-03-17修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

通訊作者：劉士超(1986-)，男，住院醫(yī)師，主要從事心血管疾病基礎(chǔ)與臨床研究。

〔中圖分類號〕R541.4

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6356-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.017