EZp基因在結直腸癌腫瘤干細胞化療中的臨床意義及耐藥作用

王　晶　劉新秀　劉　濤　吳晶晶　瞿　嬌　李品東

(華中科技大學國濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤科，湖北　武漢　430030)

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EZp基因在結直腸癌腫瘤干細胞化療中的臨床意義及耐藥作用

王晶劉新秀劉濤吳晶晶瞿嬌李品東

(華中科技大學國濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤科，湖北武漢430030)

〔摘要〕目的探討EZp基因與結直腸癌各臨床病理參數(shù)、生存期的關系以及在結直腸癌細胞耐藥模型LoVo/5-Fu中的表達情況。方法采用SP免疫組化技術檢測結直腸癌中EZp的表達情況，利用SPSS19.0軟件分析EZp的表達與結直腸癌臨床參數(shù)、生存期的關系；用半定量RT-PCR方法對EZp基因在耐藥細胞及其親本細胞中的表達情況進行驗證。結果EZp表達與Dukes分期、淋巴結轉移情況相關(P<0.05)；EZp陽性組中位生存時間為43個月，陰性組中位時間>48.74個月，兩組生存函數(shù)經(jīng)Log-Rank檢驗有統(tǒng)計學差異(χ2=5.86，P=0.015)；EZH2在LoVo/5-Fu與LoVo中的表達有差異。結論EZH2基因可能與LoVo/5-Fu細胞株耐藥機制有關，提示EZH2基因表達可能影響癌細胞對5-Fu敏感性；且EZH2基因對判斷結直腸腫瘤轉移機制以及病情進展有一定臨床價值。

〔關鍵詞〕EZH2；結直腸癌；腫瘤干細胞；耐藥性

第一作者：王晶(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤研究。

EZp(果蠅E(z)基因的同源基因)是新人類基因，屬PCG(Ploycomb Group)家族基因〔1〕，與細胞生長調節(jié)有關，通過抑制染色質中靶基因促進細胞增殖。EZp蛋白為轉錄抑制因子，可抑制多種基因活性如抑制腫瘤轉移抑制基因，EZp蛋白可促進腫瘤細胞的轉移與侵襲〔2〕。有相關報道表明EZp在多種腫瘤中已有所表達〔3〕，但關于結直腸癌的報道少見。本實驗擬觀察EZp基因與結直腸腫瘤轉移及病情進展的關系。

1材料與方法

1.1材料56例結直腸癌組織標本，均取自我院2008年3月至2011年3月普外科結直腸癌手術的結直腸癌組織標本。納入標準：①原發(fā)腫瘤；②手術前未予以化療及放療等治療。排除標準：非原發(fā)腫瘤、接受化療及放療等治療。男30例，女26例；年齡38～80歲，平均61.32歲。根據(jù)EZp在結直腸癌組織中的表達，將病例分為陽性和陰性2組進行比較。本研究末次隨訪時間為2014年3月13日，隨訪最長時限61個月。

1.2方法

1.2.1SP免疫組化方法檢測組織中EZp的表達所有標本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟，PBS液沖洗，EZp采用S-P法免疫組化染色，所用抗體濃度為EZp 1∶300。以PBS溶液代替一抗做空白對照，以排除假陽性結果。

1.2.2免疫組化結果觀察按腫瘤細胞陽性率分析結果。在(200、400倍)顯微鏡下觀察，每張切片隨機選取3～4個高倍視野。因EZp蛋白定位于細胞核，陽性反應為位于細胞核內的棕黃色顆粒，中等以上染色，且超過10%的腫瘤細胞有陽性染色者判為陽性表達，否則為陰性表達。

1.2.3細胞培養(yǎng)及耐藥細胞系的建立結直腸癌LoVo細胞在37℃，50 ml/L CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含100 ml/L熱滅活小牛血清，青霉素100 kU/L和鏈霉素100 mg/L的RPMI1640培養(yǎng)液。采用藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)持續(xù)接觸濃度遞增誘導法建立人結腸癌耐藥細胞系LoVo/5-Fu，可在含5-Fu 濃度為5.0～6.0 mg/L的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長。

1.2.4半定量RT-PCR采用TRIzol一步法提取LoVo和LoVo/5-Fu細胞的RNA；以1 μg 總RNA進行逆轉錄合成cDNA，分別進行不同循環(huán)數(shù)的PCR循環(huán)，以確定最佳擴增循環(huán)數(shù)(26～28個)，并進行溫度梯度PCR，以確定各對引物的最佳退火溫度。β-actin作為內參，EZp上游引物：5′-GCCAGACTGGGAAGAAATCTG-3′，下游引物：5′-TGTGCTGGAAAATCCAAGTCA-3′；β-actin上游引物：5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′，下游引物：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。以β-actin mRNA水平作為內參照，每個PCR產(chǎn)物取10 μl在20 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，用Alpha Innotech的凝膠成像系統(tǒng)(FluorChem IS-9900)，Alpha Ease FC軟件對電泳條帶進行分析。

1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0軟件行χ2檢驗。生存曲線的構建采用Kaplan-Meier方法，行Log-Rank檢驗。

2結果

2．1結直腸癌組織中EZp的表達與臨床病理參數(shù)的關系EZp基因在結直腸癌組織標本中的陽性率與病變部位、病理分型、分化程度、腫瘤大小無關(P>0.05)，與Dukes分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)，見表1。

2.2EZp表達與生存期的關系EZp陽性組共33例，其中7例存活，26例死亡。陰性組共23例，其中15例存活，8例死亡。陽性組中位生存時間為43個月，陰性組中位時間>48.74個月。兩組生存函數(shù)經(jīng)Log-Rank檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.86，P=0.015<0.05)。

2.3EZH2基因驗證運用半定量RT-PCR方法檢測LoVo和LoVo/5-Fu細胞中EZH2基因在轉錄水平的差異表達，結果顯示，耐藥細胞中EZH2mRNA表達有所上調,見圖1。

表1　結直腸癌組織中EZp表達與

圖1　LoVo和LoVo/5-FU細胞中EZp基因在轉錄水平的表達

3討論

近年來，結直腸癌發(fā)病率逐年上升，嚴重威脅人類健康〔4，5〕。基因在許多疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用，認為可能是疾病致病因素，目前有關基因治療這一研究方向得到相關學者重視〔6〕。APC-B-catenim-Tcf-Myc途徑與結直腸病變的機制密切相關；HNPCC通路，由于多種基因搭配錯誤及其他因素引起微病灶不穩(wěn)定，促進腫瘤無限制生長；在結直腸癌細胞中能觀察到基因過度甲基化引起的雌激素失活，但對于此途徑目前探究較少。EZp是有關學者采用酵母雙雜交實驗與原癌基因Vav蛋白產(chǎn)物相互作用過程中發(fā)現(xiàn)的人類新基因〔7〕。本研究發(fā)現(xiàn)，結直腸癌組織C、D期EZHZ陽性率高，有淋巴結轉移也明顯高于無淋巴結轉移，原因可能為由p組蛋白27位賴氨酸甲基化作用于EZp上調時，可使抑制癌細胞的基因保持沉默，又因位于pRB-E2F通路下游區(qū)的EZp去磷酸化作用，pBb結合E2F抑制S期基因轉錄的啟動，經(jīng)過一系列作用最終促進瘤細胞增殖，且EZp表達上調可抑制某些腫瘤轉移的抑制基因，臨床表現(xiàn)為促進腫瘤發(fā)生與侵襲效果〔7〕。EZp可促使腫瘤浸潤，這與上述EZp作用機制即通過HNPCC通路有關，在某種程度上會使正常結直腸組織惡化成瘤性組織。腫瘤組織發(fā)生轉移，EZp可使抑制腫瘤轉移基因保持沉默，臨床效應為促使腫瘤轉移〔8〕。當EZp上調時，EZp可使絕大部分抑癌基因沉默〔9〕。同時，EZp表達增高與腫瘤進展及預后差相關，推測其可能成為預測腫瘤預后的分子標記物。

綜上所述，EZp基因可能與LoVo/5-Fu細胞株耐藥機制有關，臨床表現(xiàn)耐藥細胞LoVo/5-Fu的EZp mRNA表達上調。提示EZp基因表達可能影響癌細胞對5-Fu敏感性；可通過EZp基因對結直腸腫瘤轉移機制及病情進展進行判斷。

4參考文獻

1林琳,許慶文,劉春安.EZp和樁蛋白在結直腸癌組織的表達及其與臨床病理參數(shù)及預后的關系〔J〕.中華實驗外科雜志,2013;30(7):1520-1.

2馬少衛(wèi).EZp、MTa-1在結直腸癌中表達及其臨床意義〔D〕.石家莊：河北醫(yī)科大學外科學碩士學位論文,2013.

3呂艷鋒,韓冰冰,禹化龍,等.抑制EZp基因表達的shRNA載體的構建及其作用〔J〕.山東大學學報(醫(yī)學版),2013;51(9):31-2.

4周桓.結直腸癌演進過程中CD133分子表達的臨床意義及調控機制〔D〕.蘇州：蘇州大學免疫學博士學位論文,2013.

5Tamagawa D,Oshima T,Numata M,etal.Global histone modification of pK27 correlates with the outcomes in patients with metachronous liver metastasis of colorectal cancer〔J〕.Eur J Surg Oncol,2013;39(6):655-6.

6Ferraro A,Mourtzoukou D,Kosmidou V,etal.EZp is regulated by ERK/AKT and targets integrin alpha2 gene to control epithelial-mesenchymal transition and anoikis in colon cancer cells〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2013;45(2):243-54.

7王建新,呂艷鋒,韓冰冰.靶向EZp基因的短發(fā)夾RNA表達載體的構建及其對人結腸腺癌SW480細胞的增殖抑制作用〔J〕.中華腫瘤雜志,2012;34(10):730-1.

8鞠海星,吳偉,胡錦林.結直腸癌中錯配修復蛋白hMLH1和hMSp的表達及臨床意義〔J〕.浙江臨床醫(yī)學,2014;16(4):505-7.

9Sponziello M,Durante C,Boichard A,etal.Epigenetic-related gene expression profile in medullary thyroid cancer revealed the overexpression of the histone methyltransferases EZp and SMYD3 in aggressive tumours〔J〕.Mol Cell Endocrinol,2014;392(1-2):8-9.

〔2014-09-17修回〕

(編輯徐杰)

通訊作者：李品東(1981-)，男，博士，主要從事腫瘤研究。

〔中圖分類號〕R735

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6436-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.058