腸三葉因子與Wnt/β-Catenin信號通路在結直腸癌中的表達及其與患者預后的關系
2016-01-29 00:41:58李鳳玉李秀娟任君旭
中國老年學雜志 2015年22期
李鳳玉 呂 洋 劉 博 李秀娟 任君旭
(中國人民解放軍第251醫(yī)院腫瘤內科，河北 張家口 075000)
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腸三葉因子與Wnt/β-Catenin信號通路在結直腸癌中的表達及其與患者預后的關系
李鳳玉呂洋1劉博2李秀娟1任君旭1
(中國人民解放軍第251醫(yī)院腫瘤內科，河北張家口075000)
〔摘要〕目的研究腸三葉因子(ITF/TFF3)與Wnt/β-Catenin信號轉導通路相關基因在結直腸癌中的表達情況及其與患者臨床病理及預后的關系。方法采用SP 免疫組織化學染色法檢測68例結直腸癌、21例結直腸腺瘤及11例正常結直腸黏膜組織中TFF3、Wnt1a、β-Catenin的表達變化；分析TFF3、Wnt1a、β-Catenin與結直腸癌患者臨床病理指標的關系；應用 Cox 單因素及多因素回歸分析探討它們在結腸癌組織中的表達與結腸癌患者預后的關系。結果①TFF3、Wnt1a、β-Catenin在結直腸癌和腺瘤組織中均有表達，Wnt1a、β-Catenin在正常結直腸黏膜組織中則均呈陰性或弱陽性表達，而TFF3呈陽性表達，各標記物在不同結直腸黏膜組織中的表達差異顯著(P均<0.05)；②Wnt1a、β-Catenin的表達均與患者的TNM分期相關，TNM分期越高的患者Wnt1a、β-Catenin的表達越強；β-Catenin與TFF3的表達則均與患者的淋巴結轉移情況相關，伴有淋巴結轉移的患者二標記物的陽性率高；Wnt1a、TFF3的表達還與患者的肝轉移情況相關，伴有遠處轉移的患者Wnt1a、TFF3的陽性率高；③Wnt1a、β-Catenin在結直腸癌的表達呈正相關(r=0.308)。β-Catenin在Wnt1a陽性組中的表達(陽性率92.6%)明顯高于在Wnt1a陰性組中的表達(陽性率65.9%)(P=0.010)；④Cox 單因素法分析TFF3、Wnt1a、β-Catenin的表達對患者腫瘤死亡的影響，結果顯示，TFF3、Wnt1a可影響患者的腫瘤死亡(P均<0.05)，陽性患者生存時間短，而β-Catenin的表達對結腸癌患者腫瘤死亡無影響(P>0.05)。結論TFF3與Wnt/β-Catenin信號轉導通路與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展及預后相關，可作為較為理想的腫瘤標志物輔助判斷患者預后并指導臨床治療。
〔關鍵詞〕結直腸癌;腸三葉因子;Wnt/β-catenin;信號通路
1河北北方學院基礎醫(yī)學院組胚教研室
2河北北方學院附屬第一醫(yī)院病理科
第一作者：李鳳玉(1978-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤的病理研究及臨床治療研究。
在胚胎發(fā)育中起著重要作用的一些信號通路常常在腫瘤細胞中亦表現(xiàn)異常，其中以Wnt信號通路最為典型〔1〕。Wnt通路是由一系列癌基因和抑癌基因編碼的蛋白質組成，其在調節(jié)胚胎發(fā)育與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等關鍵的生理、病理過程中起重要作用，而Wnt1a、β-Catenin均是Wnt信號通路的成員。腸三葉因子(ITF/TFF3)是三葉因子家族的成員之一，主要在小腸及結腸杯狀細胞、胃竇黏膜〔2〕中表達，在胃腸道炎癥、潰瘍及胃癌等疾病中呈異常表達。本研究檢測TFF3、Wnt1a、β-Catenin在結直腸癌、腺瘤和正常結直腸黏膜組織中的表達情況，探討TFF3與Wnt/β-Catenin信號轉導通路在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的相互作用及其與臨床、病理及預后的關系。
1材料和方法
1.1研究對象本研究為回顧性研究。采用隨機法從河北北方學院附屬第一醫(yī)院病理科2008年1月1日至2009年12月31日手術切除原發(fā)性結直腸腺癌215例石蠟包埋標本中選取68例，所有患者術前均未經過任何治療且均有完整的臨床病理及隨訪資料。入選病例有無淋巴結轉移明確，無淋巴結轉移病例要求送檢淋巴結數(shù)目≥12枚，淋巴結轉移病例至少有1枚淋巴結被病理證實有癌轉移。同時選取結直腸腺瘤石蠟標本21例，距癌組織>5cm的正常黏膜組織共11例作為對照，對照標本經病理證實無腫瘤細胞浸潤，無明顯炎癥，無明顯細胞增生等病變。68例結直腸癌標本中，男39例，女29例，年齡22～78歲，中位年齡56.0歲，平均年齡為54.6歲。腫瘤直徑≤5 cm 的36例(52.9%)，> 5 cm的32例(47.1%)；分化程度為高分化的16例(23.5%)，中分化28例(41.2%)，低分化24例(35.3%)；TNM分期為Ⅰ期5例(7.4%)，Ⅱ期21例(30.9%)，Ⅲ期27例(39.7%)；Ⅳ期15例(22.1%)。對68例結直腸癌患者全部進行隨訪，隨訪方式采取門診復查、電話和信訪相結合。隨訪時間為1～63個月，其中59例獲訪，9例失訪。
1.2試劑及方法兔抗人Wnt1a多克隆抗體(工作濃度為1∶100)、鼠抗人β-catenin單克隆抗體(工作濃度為1∶200)、兔抗人TFF3多克隆抗體(工作濃度為1∶100)均購自北京博奧森生物技術有限公司；S-P試劑盒、檸檬酸抗原修復緩沖液、 PBS緩沖液、抗體稀釋液、DAB顯色劑均購自石家莊勃盛化學試劑有限公司。按照S-P免疫組化檢測試劑盒中的操作方法并用高壓鍋抗原修復技術檢測TFF3、Wnt1a、β-Catenin在結直腸癌中的表達。PBS 緩沖液代替一抗作陰性對照。
1.3結果判斷TFF3蛋白、Wnt1a蛋白陽性產物均主要表達于細胞質。以出現(xiàn)灰黃色、金黃色或棕黃色顆粒記為陽性細胞，依陽性細胞占所觀察細胞的百分比及著色強度綜合計分〔3〕。由2位病理醫(yī)師分別雙盲閱片，隨機選取5個高倍鏡視野計數(shù)陽性細胞百分比的平均數(shù)，按腫瘤細胞陽性細胞數(shù)量記為0～3分，陽性細胞數(shù)目為<10%為0分，10%～49%為1分，50%～74%為2分，≥75%為3分；著色強度記為0～3分，無色為0分，灰黃色為1分，金黃色為2分，棕黃色為3分；將兩項指標的評分相加，根據(jù)總的分數(shù)分為2級，0～2分為陰性，≥3分為陽性。
β-Catenin 蛋白陽性產物定位于細胞膜、細胞質和(或)細胞核，染色結果判斷標準參照Maruyama 等〔4〕的方法，>70% 的細胞其細胞膜染色陽性為正常表達，反之為膜表達缺失；>10% 的細胞其細胞質和(或)細胞核染色陽性為細胞質和(或)細胞核陽性表達；細胞膜表達缺失及細胞質和(或)細胞核陽性表達統(tǒng)稱為異常表達。
1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗；相關性用Spearman等級相關分析，壽命表法計算生存率，生存分析比較采用Kaplan-Meier法，預后因素分析采用Cox成比例危險率模型。
2結果
2.1TFF3、Wnt1a、β-Catenin在不同結直腸黏膜組織中的表達與陰性對照實驗結果相比，Wnt1a、β-Catenin在正常結直腸黏膜組織中多呈陰性表達，在腺瘤組織中表達增強，在結直腸癌中表達明顯(圖1，圖2)。TFF3在正常結直腸黏膜表達位于細胞質中，在腺瘤組織中表達下降，而在結直腸腺癌中表達又有所增高(圖3)。TFF3、Wnt1a、β-Catenin在結直腸癌的陽性率分別為69.1%(47/68)、39.7%(27/68)和76.5%(52/68)，在結直腸腺瘤的陽性率分別為47.6%(10/21)、23.8%(5/21)和19.0(4/21)，在正常結直腸黏膜組織中的陽性率為90.9%(10/11)，9.1%(1/11)和0%(0/11)。經統(tǒng)計學分析，TFF3、Wnt1a、β-Catenin在結直腸腺癌、結直腸腺瘤及正常結直腸黏膜組織中的表達均具有顯著差異(χ2為6.550，15.704和42.563，P均<0.05)。
2.2TFF3、Wnt1a、β-Catenin的表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系Wnt1a、β-Catenin的表達均與患者的TNM分期相關，TNM分期越高的患者Wnt1a、β-Catenin的表達越強；β-Catenin與TFF3的表達則均與患者的淋巴結轉移情況相關，伴有淋巴結轉移的患者二標記物的陽性率高；Wnt1a、TFF3的表達還與患者的肝轉移情況相關，伴有遠處轉移的患者Wnt1a、TFF3的陽性率高(P均<0.05)。而TFF3、Wnt1a、β-Catenin的陽性表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小、大體類型、病理類型及分化程度等均不相關(P均>0.05)。見表1。
2.3TFF3、Wnt1a、β-Catenin在結直腸癌表達的相互關系Wnt1a、β-Catenin在結直腸癌的表達呈正相關(r=0.308)。β-Catenin在Wnt1a陽性組中的表達(陽性率92.6%)明顯高于在Wnt1a陰性組中的表達(陽性率65.9%)(P=0.010)。而 TFF3、Wnt1a以及TFF3、β-Catenin在結直腸癌的表達則均不相關(P均>0.05)。
2.4TFF3、Wnt1a、β-Catenin的表達與患者腫瘤死亡單因素分析以死亡時間及死亡結局為應變量，各因子表達為自變量，Cox 單因素法分析TFF3、Wnt1a、β-Catenin的表達對患者腫瘤死亡的影響，結果顯示，TFF3、Wnt1a可影響患者的腫瘤死亡(P均<0.05)，陽性患者生存時間短，而β-Catenin的表達對結腸癌患者腫瘤死亡無影響(P=0.073)。見表2。
結直腸腺癌(×100)
結直腸腺瘤(×200)
正常結直腸黏膜(×200)
結直腸腺癌(×100)
結直腸腺瘤(×100)
正常結直腸黏膜(×100)
正常結直腸黏膜(×200)
結直腸腺瘤(×200)
結直腸腺癌(×100)
nWnt1a陰性陽性P值β-Catenin陰性陽性P值TFF3陰性陽性P值男/女39/2927/1412/150.0818/831/210.49612/927/200.981年齡分布≤30歲4310.804130.996130.22030～60歲3823159291523>60歲261511620521腫瘤大小分布(n)T≤5cm3621150.92811250.28010260.3755
表2 Cox 單因素分析各因子的表達與
3討論
TFF3主要是由杯狀細胞分泌的特異分布于腸黏膜表面的多肽物質，在腸道內相當豐富。本研究結果印證了TFF3的這一特性。研究發(fā)現(xiàn)，TFF3在乳腺癌〔5〕、前列腺癌〔6〕、胃癌〔7〕、甲狀腺癌〔8〕等均有異常表達，且TFF3表現(xiàn)為抑癌基因和潛在促進腫瘤發(fā)展的因素〔5〕。TFF3在結腸腺瘤性息肉中表達明顯降低，在腺瘤中表達量和正常黏膜基本相同，而在黏液癌和腺癌中呈高表達〔9〕。本研究結果顯示，伴有淋巴結轉移或肝轉移的患者其表達增強，隨訪結果顯示，TFF3還可影響患者的腫瘤死亡，陽性患者生存時間短，均說明TFF3參與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展及預后。
Wnt/β-Catenin信號轉導途徑是一類重要的傳導生長刺激信號的通路，通過Wnt蛋白結合到特異受體卷曲蛋白的表面受體，然后激活GSK3信號通路，導致GSK3與β-Catenin結合，阻礙β-Catenin降解，從而激發(fā)細胞增殖信號通路。 Wnt/β-Catenin信號通路無論是在胚胎發(fā)育還是在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程中均起著重要作用〔10〕。 研究發(fā)現(xiàn)，在結直腸癌胞質內β-Catenin的增加和可能存在血行轉移有一定關系，β-Catenin的過表達與腫瘤的浸潤深度及局部去分化有關〔4〕。本研究結果顯示，Wnt/β-Catenin信號通路參與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展并與患者預后相關，這與朱月琴等〔11〕的結果一致。
4參考文獻
1Giles RH,van Es JH,Clevers H.Caught up in a Wnt storm:Wnt signaling in cancer〔J〕.Biochim Biophys Acta,2003;1653(1):1-24.
2Samson MH.Quantitative measurements of trefoil factor family peptides:possibilities and pitfalls〔J〕.Scand J Clin Lab Invest,2013;73(3):193-202.
3許良中，楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準〔J〕.中國癌癥雜志，1996;6(4)：229-31.
4Maruyama K，Ochiai A，Akimoto S，etal.Cytoplasmic beta-catenin accumulation as a predictor of hematogenous metastasis in human colorectal cancer〔J〕.Oncology,2000;59(4):302-9.
5Ahmed AR,Griffiths AB,Tilby MY,etal.TFF3 is a normal breast epithelial protein and is associated with differentiated phenotype in early breast cancer but predisposes to invasion and metastasis in advanced disease〔J〕.Am J Pathol,2012;180(3):904-16.
6Shaikhibrahim Z,Lindstrot A,Buettner R,etal.Analysis of laser-microdissected prostate cancer tissues reveals potential tumor markers〔J〕.Int J Mol Med,2011;28(4):605-11.
7Aikou S,Ohmoto Y,Gunji T,etal.Tests for serum levels of trefoil factor family proteins can improve gastric cancer screening〔J〕.Gastroenterology,2011;141(3):837-45.
8Karger S,Krause K,Gutknecht M,etal.ADM3,TFF3 and LGALS3 are discriminative molecular markers in fine-needle aspiration biopsies of benign and malignant thyroid tumours〔J〕.Br J Cancer,2012;106(3):562-8.
9John R,El-Rouby NM,Tomasetto C,etal.Expression of TFF3 during multistepcolon carcinogenesis〔J〕.Histol Histopathol,2007;22(7):743-51.
10Bryja V,Cajanek L,Grahn A,etal.Inhibition of endocytosis blocks Wnt signalling to beta-catenin by promoting dishevelled degradation〔J〕.Acta Physiol(Oxf),2007;190:55-61.
11朱月琴,范欽和,姜松梅,等.結直腸癌組織E-cadherin和β-Catenin的表達與臨床病理特征相關性研究〔J〕.中華腫瘤防治雜志,2012;19(7):510-3.
〔2013-12-29修回〕
(編輯曹夢園)
〔中圖分類號〕R735.3
〔文獻標識碼〕A
〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6441-04；
doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.060
