評估人T淋巴細胞亞群對結核桿菌脂質抗原的免疫反應①

金　亮　張　茜　李柏青　沙　泉

(安徽醫科大學免疫學教研室及過敏與免疫研究中心，合肥230032)

評估人T淋巴細胞亞群對結核桿菌脂質抗原的免疫反應①

金亮張茜李柏青沙泉

(安徽醫科大學免疫學教研室及過敏與免疫研究中心，合肥230032)

[摘要]目的：觀察結核桿菌脂質的一些脂類抗原對人外周血中淋巴細胞活化和增殖的作用，進而探討脂類抗原在結核感染中是否存在特異性的免疫作用。方法：取健康人外周血單個核細胞(PBMC)，分離誘導出非成熟樹突狀細胞(imDC)后分別加入結核桿菌脂質全脂質(TLIP)、丙酮可溶性脂質(ASLIP)、純硫脂(PSLIP)、脂阿拉伯糖(LAM)、脂甘露聚糖(LM)、同時設置非脂類抗原全菌裂解物(WCL)、培養分泌蛋白(CFP)、耐熱抗原(Mtb-HAg)、脂多糖(LPS)和空白對照組。用CFSE標記自體淋巴細胞后，與被脂質抗原刺激后的DC共培養。之后，用流式細胞儀(FCM)檢測T淋巴細胞亞群(CD4+、CD8+、NKT和 γδT)的增殖和分泌細胞因子( IFN-γ、TNF-α和 IL-4)的情況。結果：相較于空白組，所有脂質都能促進NKT細胞和CD8+T細胞增殖(P<0.05)。相較于空白組ASLIP，LAM和LM可以促進非增殖的CD4+T細胞分泌IL-4，或者促進增殖的CD4+T細胞分泌IFN-γ(P<0.05)。相較于空白對照組，所有脂質抗原(除了LM)都能促進增殖的γδT和 CD8+T細胞分泌IFN-γ和TNF-α，而LM能抑制增殖的CD8+T細胞分泌TNF-α。結論：結核桿菌脂質抗原能激活PBMC的特異性免疫反應，特別是CD1限制性T細胞的應答。

[關鍵詞]結核桿菌脂質抗原；細胞因子；T淋巴細胞亞群；增殖反應

結核病是嚴重危害人類生命健康的傳染病，據世界衛生組織(WHO)2014年報告，全世界估算每年新增850萬結核患者，有約140萬人死于結核病，中國占新增病例數的12%，僅次于印度(26%)居世界第二位[1]。目前研究表明，T細胞和其表面分子主要組織相容性復合體(MHC)Ⅰ和Ⅱ參與了保護性免疫在宿主對M.tb的蛋白抗原反應中[2]。因此，很多候選的疫苗都是通過M.tb的蛋白抗原作用于免疫細胞后，誘導出潛在的Th1反應[3]。雖然M.tb擁有一層獨特的，包含豐富脂類成分的細胞壁，但是，是否脂類成分能夠潛在地成為一種預防M.tb的疫苗，目前還很少有人知道。最近研究發現，CD1限制性T細胞識別來源于M.tb細胞壁的脂類抗原，在宿主細胞介導免疫反應中具有極其重要的作用。CD1限制性T細胞具有與MHC限制性T細胞極其相似的功能，同時在天然免疫應答中具有獨特的作用[4]。人類的CD1分子是一群抗原呈遞分子包含CD1a、b、c、d和e，這些分子結合脂質，然后呈遞他們給特異性的T細胞。CD1a、b和c 主要表達在CD4+、CD8+雙陽性的胸腺細胞內以及外周血內抗原呈遞細胞(APC)，例如DCs、單核細胞。此外在一些B細胞亞群內也有表達[5]。此外，來源于PBMC的非成熟DC(imDCs)通過與白介素4(IL-4)和粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)培養誘導后，能夠持續的表達這些分子[6]。目前用M.tb脂質制作的疫苗在guinea豬內實驗表明，其在抗M.tb方面有強烈的保護性免疫作用[7]。同時也已經發現CD1限制性T細胞能夠通過分泌大量細胞因子(例如腫瘤壞死因子、γ干擾素等)發揮保護性免疫[8]。所以我們的研究目的是為了進一步探究健康人群對M.tb脂類片段的免疫反應時，T細胞亞群(γδ T 細胞、NKT 細胞、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞)發揮的功能和特性，以此來評價脂類抗原作為新型預防結核疫苗組分或者結核治療靶點的可能性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 M.tb抗原制備由M.tbH37Rv株制備的全菌裂解物(WCL，NR-14822)、全脂質(TLIP，NR-14837)、丙酮可溶性抗原(ASLIP，NR-14842)、純硫脂(PSLIP，NR-14845)、脂阿拉伯糖(LAM，NR-14848)、脂甘露聚糖(LM，NR-14850)和培養分泌蛋白(CFP，NR-14825)均由BEI Resources，美國國家過敏和傳染病研究所(NIAID)，美國國立衛生院(NIH)提供。根據BEI提供的方法，我們溶解這些抗原按照恰當的濃度，凍存于-80℃備用。脂多糖(LPS)從Sigma購買，在-20℃凍存。結核桿菌耐熱抗原(M.tb-HAg)由蚌埠醫學院感染與免疫實驗室提供，根據先前的制備方案進行制備[9]。

1.1.2細胞的準備抽取健康志愿者外周血樣品，用Ficoll液(天津生物)根據密度離心分離出PBMC，并用RPMI1640(Gibco)洗滌三次。PBMC用臺盼藍檢測細胞活力，并且計數后，用完全RPMI1640(包含10%胎牛血清，50 U/ml青霉素，均是Gibco)重懸。在培養箱內，將細胞放置在塑料制的培養皿內培養3 h。將非黏附PBMC分離出后，用凍存液(15%DMSO和85%完全1640)重懸后，凍存于液氮罐內。而黏附PBMC繼續用完全1640培養并且加入200 U/ml 白細胞介素4(IL-4，Perprotech)和400 U/ml人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF，Perprotech)。培養至第3天，半量換液，補加同劑量細胞因子。至第6天，這些imDC用EDTA消化細胞，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌后，計數。在培養前和培養后，我們用FCM(Verse，BD)分別檢測抗原表位CD14、CD1a和CD11c的變化。

1.2方法

1.2.1樹突狀細胞成熟度檢測被誘導成功的imDC用完全1640培養液重懸后，被分布在24孔板內，50 000/孔。每孔分別加入10 μg/ml (WCL、TLIP、ASLIP、LAM、LM或PSLIP)，5 μg/ml (CFP 或M.tb-HAg )和 1 μg/ml LPS以及空白對照組。在培養箱內共培養2 d后，取樣，用FCM檢測細胞的抗原表位標志CD83。

1.2.2T細胞亞群的增殖和分泌細胞因子的檢測非黏附的PBMC被復蘇后用CFSE標記(終濃度為 1 μmol/L)，用含10%人AB型血清(Gibco)的完全1640[10]重懸后，按照20∶1比例分別放入被抗原刺激過的DC培養孔內(終濃度為1 000 000/孔)。在培養箱內培養9 d，每3 d半量換液，并加入25 U/ml 白細胞介素2(IL-2，Sigma)。至第9天，培養孔內加入10 ng/ml的PMA(Phorbo 12-myristate 13-acetate，Sigma)和500 ng/ml 的IM(Ionomycin，Sigma)，在培養箱內培養2.5 h，之后加入莫能霉素(Monesin，Sigma)繼續培養4 h。最后細胞被收集洗滌后，先用流式抗體(Biolegend,Miltenyi,BD,Invitrogen 和 eBioscience)標記CD3、CD4、CD8、γδT和NKT，室溫下避光25 min。細胞再次被洗滌后，加入透膜液(Cytoperm buffer，BD)在室溫下靜置30 min后，被透膜的細胞用流式細胞抗體IFN-γ (Biol-egend)、IL-4 (Biolegend)和TNF-α (Biolegend)胞染后，繼續在室溫下靜置30 min。處理后的細胞用PBS洗滌3次后，用含2%PFA(Paraformaldehyde )的PBS調整細胞濃度106每管細胞后，用FCM(Verse，BD)檢測。數據用Flow Jo軟件分析。單核細胞首先被圈出，接著圈出CD3+CD4+T、CD3+CD8+T和CD3+γδT 亞群細胞，之后圈出各亞群細胞在CFSE-的增殖細胞比例。同時為了確定增殖細胞分泌細胞因子的比例(圖1)，我們用十字線確定CFSE-IL-4、CFSE-TNF-α或者CFSE-IFN-γ。

1.3統計學分析采用SPSS 17.0軟件進行t檢驗或者方差檢驗，P<0.05具有統計學意義。

2結果

2.1樹突狀細胞的成熟度和分化檢測黏附細胞在IL-4和GM-CSF誘導下，培養至第6天后，其表達CD14的細胞比例相較于培養前明顯下降，而表達CD1a的細胞比例相較于培養前有明顯上升。imDCs被各種抗原刺激后，用FCM檢測CD83+細胞的表達比例，相較于空白對照組(17.8±6.8)%，WCL(35.9±5.04)%、TLIP(41.8±11.8)%、SLIP(38.2±11.7)%、ASLIP(50.3±11.5)%、LAM(43.47±14.9)%、LM(40.47±2.4)%、M.tb-HAg(30.8±5)%、LPS(41.6±14.3)%均升高(圖2A、B)。

2.2T細胞亞群增殖檢測在培養9 d后，運用FCM檢測被CFSE標記過的T細胞亞群的增殖比例。我們首先發現CFSE-CD4+T細胞的比例在各組內相較于空白對照組無明顯差異(P> 0.05)。其次CFSE-CD8+T 細胞的比例，相較于空白對照組(65.71±10.4)%，WCL (83.4±3.3)%、TLIP (81.95±2.3)%、AS LIP (83.9±2.52)%、PSLIP(83.57±7.1)%、LAM (78.92±4.8)%、LM(83±4.95)%、CFP (84.4±6.2)%、M.tb-HAg(83.65±5.2)%和 LPS(84.15±7.5)%均升高(P<0.05)。最后CFSE-NKT+細胞比例，相較于空白對照組(1.7±0.74)%，在WCL (3.91±0.94)%，TLIP

(3.31±0.92)%，ASLIP (2.78±1.21)%，PSLIP (3.41±0.93)%，LAM(3.66±2.1)%，LM(3.12±0.48)%，CFP(3.03±1.58)%，M.tb-HAg (3.34±1.6)%和LPS(3.6±1.8)%的比例均要高(P<0.05)，見圖3。

2.3T細胞亞群分泌IFN-γ、IL-4、TNF-α的檢測淋巴細胞經不同的抗原刺激培養至9 d后，用FCM檢測分泌IFN-γ、IL-4和TNF-α的增殖部分的細胞比率。

2.3.1TNF-α分泌情況①產生TNF-α的CFSE-CD8+T細胞比例，相較于空白對照組(26.5±5.5)%，WCL(45.9±6.9)%、TLIP(36.5±4.4)%、ASLIP(45.9±8.2)%、PSLIP(32.7±4.8)%、LAM(34.4±7.9)%、M.tb-HAg (37.9±2.7)% 均高于空白對照組(26.5±5.5)%，但是LM組(20.3±6.7)%卻要低于空白組對照組(P<0.05)。②TNF-α的CFSE-γδT+細胞比例TLIP(24.9±5.1)%、ASLIP(30±9.3)%、PSLIP(24.3±5.6)%、LAM(24.4±11.8)%、CFP(21.98±3.6)%、LPS(21.7± 9.6)%均高于空白對照組(13.3±2.2)%(P<0.05)。CFSE-CD4+T細胞沒有任何差異(P> 0.05)(圖4)。

2.3.2IFN-γ分泌情況①產生IFN-γ 的CFSE- CD8+T細胞比例，相較于空白對照組(5.6±2.4)%，WCL(14.4±5.9)%、TLIP(12.3±6.5)%、ASLIP(15.3±7.3)%、PSLIP(12.2±6.6)%、LAM(16.6±6.9)%、LM(15.4±5.1)%、CFP(16.5±7.4)%、M.tb-HAg(18.9±6.1)%和LPS(13.1±5.6)%均升高(P<0.05)。②產生IFN-γ 的CFSE-γδT+細胞比例，相較于空白對照組(2.9±2.3)%，下列各組WCL

(12.2±7.2)%、ASLIP(12.7±7.8)%、PSLIP(13±7.7)%、M.tb-HAg (19.2±11.5)%、LM(9.6±4.8)%和LPS(12.4±5.8)% 均升高(P<0.05)。③產生IFN-γ的CFSE-CD4+細胞比例，相較于空白對照組(3.9±2.4)%，WCL(9.4±5.2)%、TLIP(11.2± 5.9)%、ASLIP(11.9±6.2)%、PSLIP(10±4.7)%、LAM (11.5±5.2)%、LM (10.9±7.3)%、CFP(12.3±7.5)%、M.tb-HAg(15.7±7.5)%和LPS(11.2±8.1)%均要升高(P<0.05)。所以，LM能夠促進CD8+T細胞分泌IFN-γ 同時卻能抑制TNF-α的分泌(圖5)。

2.3.3IL-4分泌情況我們發現產生IL-4的CFSE-CD4+T細胞比例在各組與空白對照組相比，無顯著性差異(P> 0.05)。但是，相較于空白對照組(10.3±2.1)%，產生IL-4的CFSE-CD4+T細胞比例在WCL(12.9±2)%，ASLIP(13.6±0.8)%，LAM(12.2± 1.8)%，LM(11.7±1.2)%，CFP(14.±0.7)%，M.tb-HAg(15.2±2.7)%和LPS(15.7±1.6)% 均升高(P<0.05)(圖6)。所以ASLIP、LAM和LM能夠促進未增殖的CD4+T細胞分泌IL-4，同時促進增殖的CD4+T細胞分泌IFN-γ。

3討論

M.tb富含大量的脂質成分，且脂質能夠涉及TB的免疫病理路徑。當前的研究之一就是調查CD1限制性脂質抗原成為潛在疫苗的可能性。許多實驗已經表明，來源于M.tb細胞壁的脂質抗原能夠被表達CD1a、b或者c的已經受M.tb感染的APCs吞噬，進而呈遞給分泌Th1細胞因子的T細胞和細胞毒性T細胞(CTL)[4]。我們的實驗也證明了，這些脂質能夠促進CTL和Th1細胞分泌IFN-γ和TNF-α。不過我們還發現這些細胞是CFSE表達陰性的，也就是說他們不僅受到活化，而且還大量的增殖。比如在我們的實驗中，受脂類抗原刺激過的 CD8+T 細胞就能產生大量的IFN-γ和TNF-α并且發生明顯增殖。此外，大量研究發現γδT細胞可以識別CD1分子，比如，一些表達Vd1-TCR的T細胞亞群能夠在缺乏外源性脂類抗原情況下，識別CD1分子和自我反應。NKT細胞似乎有一個重要的、潛在的作用在宿主抵抗M.tb免疫反應中。重要的是，對NKT細胞的研究能夠提供一個模板去更好的研究其他脂質限制性T細胞在人甚至其他哺乳動物中的作用[11,12]。但是NKT細胞的活化有兩條路徑，一條是通過外源性的抗原刺激引起的(直接活化)，而另一條則是首先DCs被脂類抗原刺激并且分泌IL-12，然后IL-12增強NKT細胞表面的TCR受體，從而活化NKT細胞(非直接活化)。目前，也已經有不少證據闡明，非直接活化路徑涉及到免疫因子，這些免疫因子在許多脂類抗原免疫反應中扮演決定性的作用[14]。因此，在我們的研究中，先檢測了被TB脂類抗原刺激后的DCs的成熟度標志CD83，再進一步檢測NKT細胞的增殖情況。總而言之，在脂質被DC呈遞給CD1限制性T細胞后，這些T細胞能夠溶解受感染的細胞，從而能夠控制細菌的增長[14]。最近的報道表明M.tb的脂質成分在宿主抵抗M.tb的體液免疫反應和交叉反應中同樣也具有重要的作用[15]。我們也發現，脂類抗原ASLIP、LAM和LM既能夠誘導Th2細胞分泌IL-4，同樣也能促進Th1細胞產生IFN-γ。因此，這幾個脂質抗原是非常值得進一步研究的。此外，一些調查研究發現，在體外培養M.tb的脂質時，使用與我們相類似的方法中，只有在TB病人的樣本中，T細胞才能夠被刺激增殖，而健康人的樣本卻并無這樣的情況[16]。但是，我們認為，只要適當的延長培養時間，這些健康人的T細胞同樣能夠得到反應。雖然本實驗中，這些脂質抗原可以被DC誘導成熟，但是不能確定這些DC具體的功能狀態，比如是否是分泌IL-12從而誘導Th1細胞發生反應？此外非黏附PBMC中非T細胞(例如B細胞，NK細胞等)對脂質的反應也不太明確。這些都有待進一步的研究。總而言之，我們的實驗初步表明了M.tb脂質抗原在CD1限制性T細胞的保護性免疫反應的這條路徑，以及它的特異性免疫反應中具有重要的角色。

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[收稿2015-06-01修回2015-07-05]

(編輯倪鵬)

Evaluation of immune responses of human T lymphocyte subsets to Mycobacterium tuberculosis lipid antigens

JINLiang,ZHANGXi，LIBai-Qing,SHAQuan.DepartmentofMedicalImmunologyandAllergyandImmunologyResearchCenter,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China

[Abstract]Objective:Some antigens of M.tb to culture with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) for assaying their proliferation and activation,so as to signify whether lipid antigens of M.tb have specific immune responses in host against M.tb infection or not.Methods: We treated PBMC with several lipid antigens of M.tb to explore the ability of these antigens to activate immunity in healthy individuals.We measured and analyzed cell proliferation by labeling cells with carboxyfluorescein succinimidyl amino ester (CFSE) and subjecting them to flow cytometry (FCM).The production of IFN-γ,TNF-α and IL-4 by T cell subsets (NKT,CD4+,CD8+,and γδT) from healthy donors was analyzed by FCM after stimulation with autologous immature dendritic cells pre-cultured with M.tb lipid antigens.The tested M.tb lipid antigens were the total lipid (TLIP),Acetone-Soluble Lipids (ASLIP),Purified Sulfolipid (PSLIP),Lipoarabinomannan (LAM) and Lipomannan (LM) levels.Medium free of lipid antigens(WCL,CFP,LPS,Mtb-HAg and blank) was used as a control.Results: We found the proportion of proliferative NKT and CD8+T cells significantly increased in all lipid groups (P<0.05).ASLIP,LAM and LM promoted non-proliferative CD4+T cells to secrete IL-4 and proliferative ones to secrete IFN-γ (P<0.05).All lipid antigens promoted both proliferative γδT cells and CD8+T cells to secrete IFN-γ and TNF-α,but the proportion of TNF-α-secreting cells in these populations decreased in the LM group (P<0.05).Conclusion: Lipid antigens may affect the CD1-restricted T cells of the host to fight M.tb infection.

[Key words]M.tb lipid antigens；Cytokine；T-Lymphocyte subsets；Proliferation responses

通訊作者及指導教師：沙泉(1968年-)，女，教授，碩士生導師，主要從事過敏與氣道免疫方面的研究，E-mail:qsha2@163.com。

作者簡介：金亮(1988年-)，男，在讀碩士，主要從事免疫學方面研究，E-mail:740133167@qq.com。

中圖分類號R329.4
①本文為國家自然科學基金(No.81273245)、安徽省國際科技合作計劃(No.11030603027)。

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0159-06