Rab5a促進CpG誘導的巨噬細胞中炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素的表達①

陳俊娜　孫曉琳　董仕超　鄒　凱　劉　歡　王　巖　王　雪　劉　芳　謝基明　王玉珍

(內蒙古農業大學生命科學學院，呼和浩特010018)

Rab5a促進CpG誘導的巨噬細胞中炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素的表達①

陳俊娜孫曉琳董仕超鄒凱劉歡王巖王雪劉芳謝基明②王玉珍

(內蒙古農業大學生命科學學院，呼和浩特010018)

[摘要]目的：采用穩定表達Rab5a及其顯性負性突變體Rab5aN133I的巨噬細胞系RAW264.7，研究Rab5a及其突變體過表達后對CpG誘導的炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素的表達的影響。方法：通過脂質體法將Rab5a及其突變體Rab5aN133I的真核表達載體轉染到RAW264.7細胞中，用G418選擇性培養基進行篩選，建立穩定表達Rab5a、Rab5aN133I的細胞系。通過RT-PCR、Real time-PCR和Western blot方法鑒定穩定表達的細胞系。用CpG刺激穩定表達Rab5a、Rab5aN133I的細胞系8 h后檢測細胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-β的表達量變化。結果：RAW264.7轉染Rab5a真核表達載體后Rab5a的表達量顯著高于對照質粒轉染細胞(P<0.05)。Rab5a過表達后，在CpG刺激作用下RAW264.7分泌的TNF-α、IL-1β顯著升高(P<0.01)，IFN-β的分泌也顯著升高(P<0.05)，而Rab5aN133I過表達后上述細胞因子的分泌均有所恢復。結論：Rab5a促進了CpG誘導的巨噬細胞中炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素的表達，Rab5a可能是TLR9信號通路的正向調控蛋白。

[關鍵詞]Rab5a;CpG;TLR9;TNF-α;IL-1β;IFN-β

Rab5a存在于質膜、早期內體和網格蛋白覆蓋的囊泡上，作用是調控胞吞過程中胞吞泡和早期內體的融合以及囊泡的再循環。Rab5a在發揮功能時不斷地進行著GTP/GDP的循環[1]，富集并激活胞內多種效應分子，調控各早期內體之間以及胞吞泡和早期內體之間的融合。大量的研究證實，若Rab5a蛋白突變，可以引起細胞形態和功能發生異常，提示改變Rab5a蛋白的結構和功能，則可能導致某些疾病的發生。

Toll樣受體(TLR)作為模式識別受體家族中最重要的一員，在啟動天然免疫應答和促進適應性免疫應答的過程中起著至關重要的作用[2]。TLR9是Ⅰ型跨膜蛋白受體，它可以直接識別微生物的含有未甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤(CpG)序列的DNA[3]。人工合成的含有CpG基序的寡聚脫氧核苷酸(CpG ODN)可以模擬原核生物的DNA，激活機體的免疫系統，通過信號傳導從而促進細胞因子的合成與釋放，促進或抑制炎癥反應，從而調節免疫應答[4]。

本實驗在建立穩定表達Rab5a以及Rab5a顯性負突變Rab5aN133I的RAW264.7細胞系的基礎上，研究Rab5a對CPG誘導的巨噬細胞中TNF-α、IL-1β和IFN-β表達的影響，并探討Rab5a發揮作用的功能位點。本研究有利于深入理解天然免疫應答的調控機制，為探索感染性疾病治療的靶標提供科學的依據。

1材料與方法

1.1細胞系與試劑RAW264.7細胞株(北京協和細胞庫)，DMEM培養基、胰蛋白酶(Sigma公司)，胎牛血清(蘭州民海生物試劑有限公司)，轉染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen)，反轉錄酶、Trizol(TaKaRa)，DEPC(天根生物科技有限公司)，含有CpG基序的寡核苷酸CpG ODN(5′-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3′) 全鏈硫代修飾(上海生工)，Real time mix(北京康為世紀)，BCA蛋白檢測試劑盒(PIERCE公司)，抗體anti-Rab5a、anti-β actin(Santa Cruz公司)。

1.2實驗方法

1.2.1小鼠巨噬細胞株RAW264.7的培養RAW264.7細胞株解凍后接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養，1~2 d換液或傳代一次。

1.2.2細胞篩選RAW264.7 細胞(4×105)接種于6孔板中，DMEM培養基37℃過夜培養。將1 μg的真核表達質粒：空質粒(pcDNA3.1)、Rab5a過表達質粒(pcDNA3.1/mRab5a)、Rab5a N133I顯性負突變質粒(pcDNA3.1/tRab5a)與Lipofectamine 2000試劑溫和混勻后室溫放置20 min，以便形成質粒-脂質體復合物，然后將復合物加入到待轉染細胞中，轉染8 h后換液。48 h后加入G418(800 μg/ml)作用3周，篩選穩定表達的細胞株。

1.2.3細胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-β表達量的測定采用RT-PCR和Real time-PCR檢測Rab5a過表達及失活突變后對CpG刺激的巨噬細胞中TNF-α、IL-1β和IFN-β的影響。實驗中使用的引物序列見表1。

表1本實驗中使用的引物序列

Tab.1Primers used in experiment

Note：1 is the specific primers,2 are the Real time fluorescence quantitative PCR primers.

1.3統計學分析應用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，并采用Duncan法進行多重比較分析，P<0.05時認為具有顯著性差異。

2結果

2.1CpG促進RAW264.7細胞中Rab5a mRNA的表達有研究發現Rab5主要定位在早期胞內體中，首先我們檢測了巨噬細胞中Rab5a是否受到TLR9活化的影響，用0.3 μmol/L的CpG刺激RAW264.7細胞0、2、4、8、12、24 h后RT-PCR研究Rab5a mRNA的表達水平。如圖1所示，CpG刺激后，Rab5a的mRNA表達水平在2 h和4 h時有所升高，隨后降低并恢復至正常水平。接著我們利用Real time-PCR進行了定量分析，如圖2所示，CpG刺激2 h和4 h后Rab5a的表達水平顯著升高，而12 h時Rab5a的表達水平又恢復到正常水平。這種轉錄水平的動態變化提示，Rab5a的表達受到TLR9配體CpG的調控。

2.2Rab5a穩定表達的細胞株的鑒定如圖3A的RT-PCR結果所示，pcDNA3.1/mRab5a、pcDNA3.1/tRab5a的mRNA水平與轉染對照質粒pcDNA3.1的細胞相比，高出約2倍左右。該結果說明我們已經得到了表達上述三種質粒的細胞株。為了進一步驗證實驗結果的準確性，我們隨后利用Real time-PCR和Western blot的方法進行進一步的驗證。如圖3B和3C，所得結果與RT-PCR結果相似。根據RT-PCR、Real time-PCR和Western blot的結果來看，我們已經得到了穩定表達mRab5a及其突變體的細胞株。

2.3Rab5a促進CpG誘導的巨噬細胞中TNF-α、IL-1β和IFN-β的表達從前期的實驗結果我們可以得出，用TLR9的配體CpG活化巨噬細胞后，

mRab5a的表達水平有所升高，提示Rab5a可能參與了TLR9的信號轉導過程。為了闡明Rab5a在CpG誘導的TLR9的信號轉導通路中的作用，我們首先檢測了Rab5a對CpG刺激巨噬細胞后分泌細胞因子的影響。TNF-α、IL-1β的分泌主要是受MyD88依賴途徑的調控，如圖4和圖5所示，Rab5a過表達后，顯著地促進了CpG誘導的RAW264.7細胞中TNF-α和IL-1β的分泌。相反的，失活突變的Rab5a則可以抑制TNF-α、IL-1β的分泌。IFN-β的分泌受轉錄因子IRF7的調控，如圖6所示，Rab5a過表達后也顯著地促進了IFN-β的表達，而失活突變的Rab5a則失去了這種促進功能。

3討論

Rab蛋白參與了細胞內的蛋白轉運過程，包括囊泡的形成、遷移和融合[5,6]。但是，越來越多的證據顯示出Rab成員具有其他的生物學功能。如定位于晚期內體的GTP酶Rab7，它可以通過調控胞內營養物質的內陷和降解，從而參與到生長因子調節的細胞凋亡過程中[7]；與甲狀腺相關的腺癌中，Rab5a和Rab7的表達均有所增加[8]；在宮頸鱗癌(Cervical squamous cell carcinomas，CSCC) 組織中，Rab5a在EGFR介導的信號傳導通路中發揮正性調節作用，而Rab21則在EGFR介導的信號傳導通路中發揮負性調節作用[9]；Rab25與乳腺癌的發病密切相關；Rab39a與caspase-1結合后促進了經由caspase-1介導的IL-1β的分泌[10]。這些證據證明了Rab家族能夠參與囊泡轉運之外的多種生物進程，但是Rab家族的成員是否或如何參與調節天然免疫中TLR9信號轉導還有待探索。巨噬細胞是固有免疫應答中最重要的細胞亞群，是廣泛地存在于人體中的具有強大吞噬能力的一類細胞。除吞噬功能外，巨噬細胞中存在的模式識別受體被活化后，能誘導巨噬細胞產生大量的Ⅰ型干擾素和促炎性因子。本實驗中我們研究了Rab5a對TLR9信號通路的調控作用。TLR9被相應的配體CpG激活后，通過MyD88依賴的胞內信號轉導途徑傳遞信號。MyD88依賴途徑活化產生IL-6、IL-1β、IL-12、TNF-α等細胞因子，同樣依賴于MyD88的IRF7也可以誘導Ⅰ型干擾素如IFN-β的產生[11]。我們的實驗結果表明，Rab5a過表達后，促進了CpG誘導的促炎性因子TNF-α、IL-1β和Ⅰ型干擾素IFN-β細胞因子的產生，而失活突變的Rab5aN133I阻斷了這種效應。由于TLR信號轉導的主要輸出結果是細胞因子，我們的研究表明Rab5a可以促進CpG誘導的TLR9信號。

綜上所述，Rab5a正向調控巨噬細胞中CpG誘導的炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素的表達，Rab5a可能是一個新的正向調控TLR9信號通路的蛋白。

參考文獻：

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[2]Iwasaki A,Medzhitov R.Regulation of adaptive immunity by the innate immune system[J].Science,2010,327(5963):291-295.

[3]Arunkumar N,Liu C,Hang H,etal.Toll-like receptor agonists induce apoptosis in mouse B-cell lymphoma cells by altering NF-κB activation[J].Cell Mol Immunol,2013,10(4):360-372.

[4]He H,Genovese KJ,Swaggerty CL,etal.Differential induction of nitric oxide,degranulation,and oxidative burst activities in response to microbial agonist stimulations in monocytes and heterophils from young commercial turkeys[J].Vet Immunol Immunopathol,2008,123(3/4):177-185.

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[7]Snider MD.A role for rab7 GTPase in growth factor-regulated cell nutrition and apoptosis[J].Mol Cell,2003,12(4):796-797.

[8]Cheng KW,Lahad JP,Gray JW,etal.Emerging role of RAB GTPases in cancer and human disease[J].Cancer Res,2005,65(7):2516-2519.

[9]耿曉濤,馬棟輝,古麗娜·庫爾班,等.宮頸鱗癌EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表達與其臨床特征及近期療效的相關性研究[J].新疆醫科大學學報,2015,38(3):344-349.

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[11]Ma C,Spies NP,Gong T,etal.Involvement of DNA-PKcs in the type I IFN response to CpG-ODNs in conventional dendritic cells in TLR9-dependent or-independent manners[J].PLoS One,2015,10(3):e0121371.

[收稿2015-04-25修回2015-06-16]

(編輯張曉舟)

Rab5a promotes expression of pro-inflammatory cytokines and type Ⅰ IFN in CpG induced macrophages

CHENJun-Na,SUNXiao-Lin，DONGShi-Chao,ZOUKai,LIUHuan,WANGYan,WANGXue,LIUFang,XIEJi-Ming,WANGYu-Zhen.CollegeofLifeSciences,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhhot010018,China

[Abstract]Objective:Using the macrophage cell lines RAW264.7 stably expressing Rab5a and its dominant negative mutant Rab5aN133I as models to analyze the effect and the mechanism of Rab5a,Rab5aN133I on CpG-induced production of pro-inflammatory cytokines and type Ⅰ IFN.Methods: The eukaryotic expression vectors of Rab5a and Rab5aN133I were transfected into RAW264.7 cells by liposome,and screened with G418.The G418-resistant colonies were obtained and amplified.The transformed cell lines were identified by RT-PCR,Real time-PCR and Western blot.The production of cytokines were measured after transformed cell lines of Rab5a and Rab5aN133I was stimulation with CpG for 8 h.Results: Rab5a expression in transfected cells was significantly higher than the control cell group (P<0.05).Overexpression of Rab5a significantly promoted the production of TNF-α，IL-1β (P<0.01) and IFN-β (P<0.05) in CpG stimulated RAW264.7.The production of cytokines was restored in Rab5aN133I transfected cell line.Conclusion: Rab5a promotes CpG-induced pro-inflammatory cytokines and type Ⅰ IFN in macrophages,it may be act as a positive regulator in TLR9 signaling pathway.

[Key words]Rab5a；CpG；TLR9；TNF-α；IL-1β；IFN-β

通訊作者及指導教師：王玉珍(1976年-)，女，教授，碩士生導師，主要從事分子免疫學方面的研究，E-mail:wangyuzhen817@126.com。

作者簡介：陳俊娜(1988年-)，女，在讀碩士，主要從事分子免疫學的研究。

中圖分類號R392.1
①本文為國家自然科學基金項目(No.31270922,81360397,81560677)。
②內蒙古自治區人民醫院檢驗科，呼和浩特010020。

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0165-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.004 10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.005