黃芪多糖對甲流HA2蛋白真核表達載體免疫效果影響的研究①

褚兆蘋　吳淑慧　劉文泰　馬志紅　徐丙元　羅　俊　曹　剛　徐華洲　石玉娥　戴　軍

(河北省人民醫院婦產科，石家莊050051)

黃芪多糖對甲流HA2蛋白真核表達載體免疫效果影響的研究①

褚兆蘋吳淑慧②劉文泰②馬志紅②徐丙元②羅俊③曹剛②徐華洲②石玉娥②戴軍②

(河北省人民醫院婦產科，石家莊050051)

①本文受河北中醫學院博士科研基金(BSZ2014002)和河北省衛生廳課題(20130139)資助。

②河北中醫學院基礎醫學院，石家莊050200。

③四川大學基礎醫學與法醫學院微生物教研室，成都610041。

[摘要]目的：檢驗不同劑量黃芪多糖對甲流HA2蛋白真核表達質粒免疫大鼠效果的影響。方法：首先，將編碼HA2的質粒pHA2/EGFP轉染CHO細胞，通過PT-PCR和熒光檢驗其在真核細胞中的表達效果。然后將60只大鼠隨機分為6組，分別注射pEGFP-N1、生理鹽水和pHA2/EGFP加不同濃度的黃芪多糖，注射前收集大鼠血清作為對照，據最后一次注射后第36天處死各組大鼠收集各組大鼠的血清，測量血清中細胞因子IFN-γ、IL-4和血清中IgG對不同流感毒株血凝素的反應情況。結果：pHA2/EGFP+中等劑量APS組的IFN-γ、IL-4和血清中IgG對血凝素的反應情況均與低劑量組和陰性對照組有顯著性差異(P<0.05)。pHA2/EGFP+中等劑量APS組的細胞因子水平和對血凝素反應與高劑量組無顯著性差別(P>0.05)。結論：中等劑量的黃芪多糖能增強甲流HA2蛋白真核表達質粒的免疫效果。

[關鍵詞]流感病毒；血凝素；IFN-γ；IL-4

甲型流感病毒是由八個RNA片段和其編碼的蛋白組成的正黏液病毒，該病毒導致了很多次流感世界性大流行[1,2]，每次世界性大流行均給世界造成了很大損失，所以預防甲型流感病毒的感染非常重要。組成流感病毒的蛋白中與預防關系最為密切的是血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經氨酸酶(Neuraminidase，NA)，針對HA的抗體可以阻止流感病毒侵入細胞，從而起到很好的預防作用。但HA變異非常厲害，這導致流感病毒能夠逃脫人體免疫的監視，這也是甲流病毒反復流行的重要原因。

如何更有效地預防甲型流感病毒？我們通過下載National Center for Biotechnology Information (NCBI)上不同流感病毒HA序列并進行序列比對后發現甲型流感病毒HA的序列中自N段開始從350號氨基酸到C段的氨基酸序列在不同流感病毒株之間序列比較保守，該序列位于流感病毒HA的尾端(HA2)，所以如果我們能夠誘導出針對HA2的有效免疫，那么我們就能更有效地控制不同流感病毒株的感染。但HA2在自然界中免疫原性比較差[3,4]，所以提高HA2的免疫原性就非常重要。黃芪多糖(Astragalus polysaccharides increase，APS)具有調節免疫作用[5]，一定劑量的黃芪多糖對免疫細胞有刺激作用，那么APS是否能夠能提高表達HA2的真核表達載體的免疫原性？針對這個問題，我們設計了以下實驗。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料pEGFP-N1購自美國的Clontech公司，HA2序列(A/PR/8/34的HA部分序列，自羥基端開始從1050號核苷酸到1730號核苷酸序列)由英韋創津公司合成。實驗前我教研室已經將HA2序列插入pEGFP-N1中，酶切位點為EcoRⅠ和BamHⅠ，此質粒命名為pHA2/EGFP。CHO細胞系購自美國ATCC。Escherichia coli DH5a感受態細胞購于全式金生物技術有限公司。雄性Wistar 大鼠60只，12 周齡，體重(200±20)g，購自河北醫科大學實驗動物中心[合格證號SCXK(冀)2014-1-003]，清潔級。

1.1.2儀器微量臺式高速冷凍離心機(Thermo 公司)；微量可調加樣器(Eppendorf)；電熱恒溫培養箱(上海福瑪實驗設備有限公司)；高速離心機(上海安亭科學儀器廠，TGL-18C)；基因擴增儀(Thermo 公司，TCP0096)；電泳儀(北京六一儀器廠，DYCZ-20C)；酶標儀(北京六一儀器廠，WD-2103A)；凝膠成像系統(美國伯樂公司，GelDoc XR+)等。

1.1.3藥物與試劑黃芪多糖購自西安沃森生物科技有限公司；不同株流感病毒純HA蛋白H5和H1均購自BD公司；RT-PCR試劑盒購自北京全式金生物公司；HRP標記的羊抗大鼠IgG抗體購自北京華夏遠洋科技有限公司；組織裂解液購自武漢博士德公司；IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒購自武漢博士德公司；Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1細胞轉染CHO細胞用含有10%FBS、1%青鏈霉素的1640培養基，在5%CO2、37℃條件下在六孔板中培養。培養至細胞匯合約60%時，按Lipofectamine 2000試劑盒說明書將質粒pHA2/EGFP和pEGFP-N1轉染CHO細胞，以生理鹽水(NS)作為空白對照。轉染48 h后，觀察EGFP綠色熒光表達情況。

1.2.2HA2基因表達的檢測收集各組轉染細胞，按照RT-PCR試劑盒要求提取總RNA后，做RT-PCR。HA2的上游引物為CCGCTCGAGTATTGAAGGGGGATGGA，下游引物為CGCGGATCCTCATATTTCTGAAATTCTAAT，長度為700 bp。RT-PCR條件參照試劑盒要求條件進行。RT條件如下：采用20 μl體系，第一鏈cDNA合成溫度為42℃，30 min；PCR條件為95℃，5 min。95℃，30 s，56℃，30 s，72℃，60 s，共進行25個循環。PCR結束后，進行電泳。電泳條件為含溴化乙錠的1%的瓊脂糖凝膠上樣后，100 V，45 min，電泳結束后，在凝膠成像系統紫外燈下照相。

1.2.3動物分組Wistar大鼠60只，隨機分為六組，每組10只。六組分別是pEGFP-N1組、pHA2/EGFP+高劑量APS組(pHA2/EGFP+high dose of APS，pHA2/EGFP+hAPS)、pHA2/EGFP+中劑量APS組(pHA2/EGFP+medium dose of APS，pHA2/EGFP+mAPS)、pHA2/EGFP+低劑量APS組(pHA2/EGFP+low dose of APS，pHA2/EGFP+lAPS)、pHA2/EGFP組和生理鹽水組(Normal saline，NS)。pEGFP-N1組給予大鼠雙側后腿股四頭肌肌內注射pEGFP-N1空質粒共100 μg，每側各50 μg，共注射兩次，間隔3周；pHA2/EGFP+hAPS組給予pHA2/EGFP共100 μg，每側各50 μg，共注射兩次，間隔3周，同時腹腔注射黃芪多糖0.9 g/(kg·d)，連續腹腔注射3周；pHA2/EGFP+mAPS組在注射pHA2/EGFP同時腹腔注射黃芪多糖0.5 g/(kg·d)，連續腹腔注射3周；pHA2/EGFP+lAPS在注射pHA2/EGFP同時腹腔注射黃芪多糖0.1 g/(kg·d)，連續腹腔注射3周；pHA2/EGFP組給予pHA2/EGFP共100 μg，每側各50 μg，共注射兩次，間隔3周；生理鹽水組給予生理鹽水每側各50 μl，共注射兩次，間隔3周。

1.2.4標本收集以上各組給藥前收集大鼠尾靜脈血液，分離血清，標記為免疫前血清，置-70℃備用。最后一次給藥結束36 d處死各組大鼠，收集各組大鼠的血液，分離血清，標記為免疫后血清置-70℃備用。

1.2.5血清細胞因子測定按照博士德公司的IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒說明書測定保存血清的IFN-γ和IL-4水平。

1.2.6抗體水平測定將H1和H5用PBS稀釋至200 ng/ml，再向空白ELISA板每孔中加入100 μl H1或H5，4℃包被過夜，封閉液洗滌待用。將各組血清分別加入包被好的各個孔中，每個孔加入100 μl血清，4℃過夜，洗滌，然后每孔中在加入100 μl稀釋后的HRP標記的羊抗大鼠IgG抗體(1∶5 000稀釋)，洗滌后加入底物顯色10 min，終止反應后測定490 nm的OD值。實驗重復3次，每個標本取平均值作為結果。

2結果

2.1重組質粒pHA2/EGFP的細胞轉染和鑒定重組質粒pHA2/EGFP按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書轉染CHO細胞，轉染48 h后觀察GFP的綠色熒光表達情況。如圖1所示pHA2/EGFP和pEGFP-N1組均有熒光出現。如圖1、2所示，收集各組細胞進行RT-PCR后只有pHA2/EGFP組出現700 bp左右的條帶。

2.2各組大鼠血清細胞因子水平各組大鼠血清細胞因子變化如表1所示，pHA2/EGFP+mAPS組血清IL-4水平和IFN-γ水平與pHA2/EGFP+lAPS組有顯著性差異(P<0.05)。pHA2/EGFP+mAPS組血清IL-4水平和IFN-γ水平與pEGFP-N1組有差異(P<0.05)。pHA2/EGFP+mAPS組血清IL-4水平和IFN-γ水平與pHA2/EGFP+hAPS組無顯著性差異(P>0.05),pEGFP-N1組與生理鹽水組無顯著性差異(P>0.05)，pHA2/EGFP組與pHA2/EGFP+lAPS組無顯著性差異(P>0.05)。

2.3各組大鼠血清IgG水平如表2和表3所示，免疫前各組血清無顯著性差別。免疫后pHA2/EGFP組、pHA2/EGFP+lAPS組、pHA2/EGFP+mAPS組和pHA2/EGFP+hAPS組血清IgG水平與免疫前上述組血清有顯著性差異(P<0.05)。當使用H1包被ELISA板時，pHA2/EGFP+mAPS組測得反映血清IgG量的OD值與pHA2/EGFP+lAPS組和pEGFP-N1組均有顯著性差異(P<0.05)。pHA2/EGFP組與pHA2/EGFP+lAPS組無顯著性差異(P>0.05)。當使用H5包被ELISA板時，我們也得到了相似結果，區別只是使用H5包被ELISA板時，測得的OD值低于使用H1包被ELISA板得到的OD值。免疫前各血清OD值無顯著性差別(P>0.05)。當使用H1或H5包被ELISA板時，pHA2/EGFP+mAPS組測得反映血清IgG量的OD值與pHA2/EGFP+hPS無顯著性差別(P>0.05)。pHA2/EGFP組與pHA2/EGFP+lAPS組無顯著性差異(P>0.05)。

Note：vs pHA2/EGFP+lAPS,1)P<0.05;vs pHA2/EGFP，2)P<0.05；vs pHA2/EGFP+hAPS，3)P>0.05.

Note：vs pHA2/EGFP+lAPS，1)P<0.05；vs pEGFP-N1，2)P<0.05.

Note：vs pHA2/EGFP+lAPS，1)P<0.05；vs pEGFP-N1，2)P<0.05.

3討論

甲型流感病毒屬于正黏病毒科RNA病毒，其核酸由八個片段組成。甲型流感病毒以感染肺部為主，具有明顯的嗜肺性[6]。該毒曾經數次引起世界性大流行，給世界造成很大損失，以預防甲流病毒非常重要。在預防甲流病毒方面，位于甲流病毒表面的HA非常重要[7,8]。HA包括兩個部分，分別是位于頭端的HA1和位于尾端的HA2。有報道認為，抗HA的抗體能很好阻止甲流病毒進入靶細胞。所以如果能誘導機體產生大量抗HA的抗體，就可以很好預防甲流病毒。但甲流HA包括H1、H5等數個血清型且變異頻率非常高，這給甲流病毒的預防帶來了很大困難。

我們通過對不同毒株的甲流病毒HA分析發現，甲流病毒HA的尾端(HA2)非常保守[3,4]，如果能夠誘導出針對HA2的抗體我們就可以很好地預防甲流病毒，但HA2 免疫原性比較差，如何增強HA2的免疫原性就顯得非常重要。而很多文章報道，中藥黃芪的主要成分黃芪多糖能夠調節免疫，那么黃芪多糖是否可以用于增強HA2的免疫原性？我們的實驗結果證實一定劑量[0.5 g/(kg·d)]黃芪多糖與表達HA2的真核表達載體聯用確實能夠誘導機體產生更多的IFN-γ和IL-4，但當劑量過低時并不能誘導機體產生IFN-γ和IL-4，甚至當抑制免疫的一些藥物與黃芪多糖同時使用時，黃芪多糖可能還會在一定程度上抑制免疫，以前我們的實驗結果也說明了這一點[9]，這個現象的機理還需要進一步研究。IFN-γ與細胞免疫關系密切，在機體中可以起到抗病毒作用[10]。而黃芪多糖誘導機體產生更多IFN-γ就意味著黃芪多糖能夠增強機體的細胞免疫。IL-4與體液免疫關系密切[11]，黃芪多糖誘導機體產生更多IL-4，就意味著黃芪多糖能夠增強機體的體液免疫。而血清IgG的結果也證實當使用中等劑量黃芪多糖時，機體產生的抗體確實增加了，這也從一個側面說明體液免疫得到了有效加強。我們的實驗結果還說明超過中等劑量的黃芪多糖并不能無限增強免疫，這提示我們今后使用黃芪多糖時，劑量不是越大越好的。

HA2上存在很多保守的表位[3,4]。我們的實驗結果也證實使用A/PR/8/34(H1N1)的HA2免疫大鼠可以使大鼠產生抗體能同時對抗H1和H5。以前，我們使用小鼠也得出相同的結果[3,4]，這說明使用表達HA2的質粒免疫不同動物確實可以誘導機體產生能結合多種HA的抗體，這些研究為馬上進行的臨床試驗打下了基礎。有意思的是抗體與H5結合的能力略小于與H1的結合能力，這說明H5的HA2部分與H1有部分差別。盡管這樣，抗體與H5結合力仍遠大于陰性對照。這說明使用H1的HA2部分誘導出的抗體也能結合H5。在血凝素為H5的毒株中有相當多的是禽流感，有部分甚至是高致病性的禽流感，這些禽流感致死率高，而且因為對禽類也有很高致死率，所以使用國際通用的雞胚來生產疫苗的方法，如果用來生產抗高致病性禽流感的疫苗將非常困難，而且禽流感在我們也時常發生，而本實驗結果也為生產這種抗高致病性禽流感的疫苗找到了一種方法。

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[收稿2015-08-15修回2015-09-15]

(編輯張曉舟)

Research of astragalus polysaccharides increasing immune effect of influenza A virus HA2 eukaryotic expression vector

CHUZhao-Ping,WUShu-Hui,LIUWen-Tai,MAZhi-Hong,XUBing-Yuan,LUOJun,CAOGang,XUHua-Zhou,SHIYu-E,DAIJun.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,GeneralHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang050051，China

[Abstract]Objective:To study the astragalus polysaccharides (APS) effect on immune induced by influenza A virus HA2 eukaryotic expression vector.Methods: The HA2 encoded by the DNA vaccine vector was efficiently expressed in CHO cells,as determined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and fluorescence analysis.60 rats were divided into six groups randomly,which were immunized with normal saline,pEGFP-N1,pHA2/EGFP+different dose of APS by intramuscular injection.The control sera were collected before injection.After injected the 36th day,sera were collected to analyzing IFN-γ,IL-4 and IgG level.Results: IFN-γ,IL-4 and IgG level of pHA2/EGFP+mAPS group was different from that of pEGFP-N1 group or pHA2/EGFP +lAPS group(P<0.05).Conclusion: Middle dose of APS could increase immune induced by influenza A virus HA2 eukaryotic expression vector.

[Key words]Influenza A virus;Hemagglutinin;IFN-γ;IL-4

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.010

通訊作者及指導教師：戴軍(1976年-)，男，博士，講師，主要從事核酸疫苗研究工作，E-mail:calldj@163.com。

作者簡介：褚兆蘋(1978年-)，女，碩士，主治醫師，主要從事婦科感染性疾病研究，E-mail：2582079419@qq.com。

中圖分類號R373.1

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0189-05