骨髓間充質干細胞對肝豆狀核變性合并肝纖維化肝功能的臨床研究①

張東鋒　王煜姝　滕軍放

(鄭州人民醫院，鄭州450003)

·生物治療·

骨髓間充質干細胞對肝豆狀核變性合并肝纖維化肝功能的臨床研究①

張東鋒王煜姝滕軍放②

(鄭州人民醫院，鄭州450003)

[摘要]目的：探討骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)治療對肝豆狀核變性肝纖維化患者肝功能及其血清學指標的影響。方法：將60例確診肝豆狀核變性肝纖維化患者隨機分為：青霉胺組、BMSCs組和BMSCs+青霉胺組。無菌條件下進行骨髓干細胞采集、分離、鑒定。青霉胺組：口服青霉胺(每日40 mg/kg),12周；BMSCs組：將骨髓間充質干細胞液2 ml+生理鹽水100 ml經外周靜脈移入人體，10 d 1次，3次為一個療程；BMSCs+青霉胺組：青霉胺(40 mg/kg)口服，12周，同時經外周靜脈輸入BMSCs，方法同上。分別于治療0、4、8、12周檢測血總膽紅素(total bilirubin,TBIL)、丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、白蛋白(Albumin，ALB)、膽堿酯酶活力(Cholinesterase,CHE)、血小板衍生生長因子-BB(Platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)、轉化生長因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α) 的含量，并做組間比較，分別于治療前后做肝組織病理活檢。結果：BMSCs+青霉胺組肝組織活檢肝纖維化整體改善較其他兩組明顯；各組TBIL、ALT、ALB、CHE、PDGF-BB、TGF-β1、IL-6和TNF-α均持續降低，但BMSCs+青霉胺組中肝功能改善和細胞因子的降低比其他組更明顯，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論：BMSCs聯合青霉胺治療對肝豆狀核變性合并肝纖維化肝功能有明顯改善。

[關鍵詞]肝豆狀核變性；肝功能；骨髓間充質干細胞；青霉胺

肝豆狀核變性(Hepatolenticular degeneration，HLD)因伴隨銅離子代謝失衡，常導致多器官受累。肝臟作為最主要的代謝場所更易受到損害，如若發展為肝硬化乃至失代償其治療更為棘手[1]。為探索HLD肝纖維化患者的治療，現收集我院肝豆狀核變性肝纖維化患者，并使用骨髓間充質干細胞 (Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)聯合青霉胺治療，研究該治療對HLD合并肝纖維化患者肝功能以及相關細胞因子的改變。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料肝豆狀核變性患者合并肝纖維化患者來源于我院住院患者，均已明確診斷。排除標準：患者年齡18~65歲；孕婦或哺乳期婦女；合并心、肺、腎等重要臟器功能不全者；嚴重感染者；伴有惡性腫瘤者；合并如肝性腦病、肝腎綜合征、上消化道大出血等嚴重并發癥患者；合并嚴重出血傾向者；過敏體質等其他嚴重情況影響治療者。選取我院住院患者60例，男性32例，女性28例，年齡18~50歲，平均年齡(28.92±7.25)歲；入組患者生命體征平穩，所有治療患者在知情同意的情況下，簽定《知情同意書》。

1.1.2藥物、試劑及儀器青霉胺(0.125 g/片，上海信誼制藥公司)，生理鹽水(100 ml，四川科倫藥業股份有限公司)，2%利多卡因(天津藥業集團)，DMEM培養液(美國Gibco公司)，Percoll分離液(美國GE Healthcare公司)，酶聯免疫吸附試劑盒(美國R&D)。

1.2方法

1.2.1實驗分組將符合納入標準的患者隨機分為三組：青霉胺組、BMSCs組、BMSCs+青霉胺組。①青霉胺組：給予青霉胺(40 mg/kg)口服，12周。②BMSCs組：將3×106細胞/ml的BMSCs液2 ml加入100 ml生理鹽水，經外周靜脈移入人體，10 d1次，3次為一個療程。③BMSCs+青霉胺組：青霉胺(40 mg/kg)口服，12周，同時經外周靜脈輸入BMSCs，方法同上。

1.2.2骨髓干細胞采集、分離、鑒定①術前做好患者思想工作，安撫緊張情緒。②無菌條件下，使用2%利多卡因局部麻醉，于雙側髂后上棘進行骨髓穿刺，抽取骨髓約50~80 ml，加入肝素抗凝。③以2 000 r/min×20 min離心骨髓，去除上層脂肪細胞，用等量DMEM培養液將骨髓稀釋為細胞懸液。④將細胞懸液加入Percoll分離液，離心1 200 r/min ×25 min。⑤吸取細胞層，使用生理鹽水洗脫，1 500 r/min×5 min，重復3次。⑥使用生理鹽水重懸細胞，細胞計數在1×108/L~10×108/L之間，4℃保存。⑦使用流式細胞儀進行BMSCs表面標記測定： CD44、CD90為陽性(均大于90%)，CD34、CD45為陰性(均小于5%)。

1.2.3實驗室檢查分別于治療前和治療后4、8、12周抽取病人外周血5 ml，測定血中總膽紅素(Total bilirubin,TBiL)、丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、白蛋白(Albumin，ALB)、膽堿酯酶活力(Cholinesterase,CHE)的值。測定血小板衍生生長因子-BB(Platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)、轉化生長因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α) 、白介素6(Interle-ukin-6，IL-6)的含量，采用酶聯免疫吸附試驗方法檢測，具體操作步驟詳見說明書。

1.2.4肝組織病理標本實時B 超引導下經皮肝組織穿刺活檢術，由配套活檢槍使用16G活檢針進行，保證所取的肝組織標本長1.2~1.8 cm。標本經連續切片后作常規伊紅染色和網狀纖維染色，根據1995年中華醫學會肝病分會肝纖維化分期診斷標準，將纖維化分為S0~S4期。S0期，無纖維化；S1期，匯管區纖維化擴大；S2期，匯管區周圍纖維化纖維間隔形成，小葉結構保留；S3期，纖維間隔形成伴小葉結構紊亂，無肝硬化；S4期，早期肝硬化。(肝纖維化病理分期與肝血流動力學、肝纖維化指標的關系)。由專門的病理學醫師進行診斷及分析。

2結果

2.1不同組血清中TBIL和ALT表達各組中治療12周后TBIL和ALT較治療前均有所降低，各組間相比較，BMSCs+青霉胺組降低最明顯，與青霉胺組、BMSCs組相比差異有統計學意義，P<0.05(圖1、2)。

2.2不同組血清中ALB和CHE表達各組中治療12周后ALB和CHE較治療前均有所升高，各組間相比較，BMSCs+青霉胺組升高最明顯，與青霉胺組、BMSCs組相比差異有統計學意義，P<0.05(圖3、4)。

2.3不同組血清細胞因子表達治療12周后各組中PDGF-BB、TGF-β1、IL-6和TNF-α各類細胞因子較治療前均降低，各組間相比較，BMSCs+青霉胺組降低最明顯，與青霉胺組、BMSCs組相比差異有統計學意義，P<0.05(圖5~8)。

2.4肝組織病理檢查結果肝組織病理檢查顯示青霉胺組纖維化分期2例由S2期變為S1期，BMSCs組5例由S2期變為S1期，3例由S3期變為

S2期，BMSCs+青霉胺組7例由S2期變為S1期，3例由S3期變為S2期，3例由S3期變為S1期，2例由S4期變為S3期(圖9)。

3討論

HLD由于銅離子排泄障礙而在肝內緩慢蓄積，導致肝細胞壞死，纖維組織增生，引起細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)在肝內不斷沉積，進而導致纖維化。肝纖維化是肝臟受到慢性損傷時發展為肝硬化的初期階段，而肝纖維化甚至早期肝硬化可以逆轉已成為共識[2,3]。因此探討HLD肝臟受損初期改善肝功能逆轉肝纖維化的治療就顯得尤其重要。

BMSCs因易于取材，便于分離培養，具有較強的分化潛能，并且可自體移植，越來越受到學者們的青睞，被認為是不久即將被引入臨床治療的最優干細胞。目前國內外有大量研究表明，骨髓間充質干細胞可以通過分化為肝細胞進而有效改善肝功能，并且有較少的副作用[4-6]。肝纖維化進程中PDGF-BB、TGF-β1等細胞因子發揮著關鍵作用，多種細胞因子參與肝星狀細胞的激活和肝纖維化的發生和發展[7,8]。

PDGF是近年來開始研究的一個細胞因子,在肝纖維化形成過程中發揮重要作用[9]。研究表明PDGF-BB在肝纖維化進展過程中更為重要[10]。血清PDGF-BB水平可以影響肝臟損傷和肝纖維化[11]。已有研究表明PDGF可以通過激活PDGF-b R/NLRP3/caspase1 通路促進炎癥因子的釋放[12]。BMSCs可能通過干擾PDGF信號通路引起血清中PDGF減少而發揮改善肝功能的作用，但具體分子機制仍需要進一步研究。

本研究發現BMSCs和青霉胺治療后炎癥因子TGF-β1、TNF-α、IL-6均有所下降。青霉胺可以促進銅排出，減輕肝臟損傷，BMSCs促進肝細胞恢復再生，進而導致影響肝功能的炎癥因子減少。TGF-β1在肝纖維化初期發揮關鍵作用，主要作用是促進ECM合成并抑制其降解，血漿TGF-β1水平與肝纖維化程度正相關[13]。研究發現一些miRNAs(如miR-31)可以通參與TGF-β/Smad3信號通路調節肝纖維化[14]。TNF-α可以通過活化TGF-β和PDGF等細胞因子并與之形成調節網絡，調節基質金屬蛋白酶參與肝纖維化[15,16]。TNF-α與PDGF等細胞因子可導致Kupffer細胞大量釋放炎癥因子,進而參與肝損傷過程[17]。IL-6可以聯合TNF-α共同刺激Kupffer細胞，釋放諸如TGF、PDGF等細胞因子,形成正反饋作用,產生更多的ECM[18]。可見BMSCs和青霉胺可以降低血清中多種細胞因子的表達，有利于促進肝功能的恢復，但其具體分子機制不一而同，需要進一步動物實驗才能驗證。 總之，我們的研究發現在運用青霉胺聯合BMSCs治療HLD肝纖維化時，可能通過協同作用降低各類損傷肝臟的細胞因子進而使肝功能得到改善。國內外已有大量研究表明干細胞移植可以緩和肝纖維化，改善肝功能，并且具有較廣泛的應用范圍[19,20]。進一步提示骨髓間充質干細胞治療技術有望在治療HLD肝纖維化中得到更廣泛的臨床應用。

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[收稿2015-04-20修回2015-09-28]

(編輯倪鵬)

Clinical research about liver function of hepatolenticular degeneration combined liver fibrosis by transplantation of bone marrow stem cells

ZHANGDong-Feng，WANGYu-Shu，TENGJun-Fang.ZhengzhouPeople′sHospital，Zhengzhou450003，China

[Abstract]Objective:To evaluate the influence of bone marrow stem cells (BMSCs) in the serological indicators of hepatolenticular degeneration combined liver fibrosis.Methods: 60 cases were randomly divided into 3 groups: penicillamine group, BMSCs group and BMSCs+penicillamine group.BMSCs(2 ml)were injected into vein with normal saline(100 ml) every 10 days ( 3 times for a period of treatment).Liver tissue pathology biopsy was inspected and TBIL, ALT, ALB, CHE, PDGF-BB, TGF-β1, IL-6 and TNF-α were detected at 0,4,8 and 12 weeks.Results: The level of serological indicators about liver functions were reduced in every group, while the changes in BMSCs+penicillamine group were especially obvious (P<0.05).Conclusion: Penicillamine combined with BMSCs was effective in the improvement of liver functions of hepatolenticular degeneration combined liver fibrosis.

[Key words]Hepatolenticular degeneration；Liver function;Bone marrow stem cells；Penicillamine

作者簡介：張東鋒(1976年-)，男，在讀博士，副主任醫師，主要從事運動障礙病方面研究，E-mail:zhangdongfeng_hn@163.com。

中圖分類號R742.4
①本文為鄭州市科技計劃項目(121PPTGG494-1)。
②鄭州大學第一附屬醫院，鄭州450052。

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0193-05