葡萄球菌腸毒素超抗原廣譜抑制性多肽的設計及空間結構研究

王思雄　馬惠文　王東林

(重慶市腫瘤研究所,重慶400030)

葡萄球菌腸毒素超抗原廣譜抑制性多肽的設計及空間結構研究

王思雄馬惠文王東林①

(重慶市腫瘤研究所,重慶400030)

[摘要]目的：以SEs氨基酸高度保守序列作靶序列設計抑制性多肽，研究篩選出的多肽P72的空間結構。方法：用生物信息學軟件“Vector NTI 10.3，InsightII 2000,Discovery Studio 1.7”等分析及預測多肽P72的空間結構。結果：P72在SEA、SEB和SEC的同源序列在空間結構具有高度的相似性，P72遠離SEB的TCR和MHCⅡ結合位。結論：P72可能不是與MHCⅡ類分子及TCR結合而產生的抑制作用，其具體的抑制機制有待深入研究。

[關鍵詞]葡萄球菌腸毒素;超抗原;合成多肽

葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxin SEs)屬于超抗原(SAg)，SEs進入體內，使得T淋巴細胞被大量激活，誘發機體強烈免疫反應，導致機體免疫系統紊亂。對于該毒素的治療，常常應用被動免疫療法的抗毒素血清，如國外有學者利用小鼠模型，構建包含葡萄球菌腸毒素A(SEA)和毒性休克綜合征毒素(TSST-1)的融合蛋白產生的抗體，結果顯示該抗體對SEs的致休克效應具有保護作用[1]。但是抗毒素血清無法應用于預防，另外其本身能激發人體的免疫反應而產生毒性。因此，針對SEs超抗原的致病機制，探討新的主動免疫治療手段，才可起到防治的目的。本研究通過對SEs氨基酸序列對比分析，設計并篩選對SEs具有廣譜抑制活性的多肽，并通過對該多肽空間結構研究，探討其廣譜抑制功能的機制，為SEs相關疾病的防治提供新的手段。

1材料與方法

1.1抑制性多肽的設計根據已經報道的SEs家族的氨基酸序列排列，對SEs的下列特征進行研究。

SEs超抗原的氨基酸序列進行對比分析，找出氨基酸序列的同源部分序列[2]。用Vector NTI 10.3軟件對SEs家族氨基酸序列進行同源性比較，并用Gene Doc軟件顯示和編輯比較結果。以SEB氨基酸序列作為肽設計的靶序列，并用Discovery Studio 1.7軟件對SEB和SEC超抗原與MHC 結合位點進行顯示和分析。

1.2多肽的合成采用Fmoc固相合成多肽(上海生工生物工程有限公司)，色譜測定純度均為95%以上。

1.3蛋白質序列檢索自瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)提供的Swiss-Prot蛋白質數據庫(http://expasy.hcuge.ch/sprot/index.htm)。蛋白質三維結構包括SEA(PDB accession code:1SXT)、SEB(PDB accession code:3SEB)、SEC2 (PDB accession code:1STE)、SEB-HLA DR1(PDB accession code:1SEB)。

1.4分子模型的顯示、計算和結構預測以PDB數據庫中的SEB 晶體結構的對應區域為模板，模擬了肽的三維結構。結構預測采用的是Sali等開發的一種基于“空間制約條件”的方法，計算工作均使用BIOSYM/MSI分子模擬系統，使用的軟件是InsightII 2000 及Discovery Studio v1.7。

2結果

2.1SEs超抗原與MHC 結合的空間結構對比分析對SEB和SEC超抗原的空間結構進行對比分析，結果顯示SEB和SEC的42~46位、92~98位氨基酸均與MHC直接接觸，而且呈線性，位于非結構區域(圖1A,B)，因此，根據這些氨基酸序列可以設計抑制性多肽。

2.2SEs氨基酸序列同源性及其MHC、TCR結合位對比分析SEA、SEB、SEC3、SED和SEE的同源性在33%~81%之間，具有多個高度同源性保守區域(同源性超過80%)，已經報道的SEs的某些MHC和TCR結合位于高度保守區。

2.3抑制性多肽的設計通過SEs氨基酸序列同源性及空間結構的比較，根據SEs氨基酸序列保守區域及及其MHC和TCR的結合位，設計了9條多肽，這些多肽均位于氨基酸序列保守區，其中P40、P113包含MHC結合位，P11、P19、P91包含TCR結合位。經過篩選，9條多肽中，P72能顯著抑制SEs的促人PBMC增殖活性，其余多肽抑制作用不明顯[3]。

2.4多肽P72的空間結構多肽P72在SEA、SEB和SEC2中的同源序列見圖2，從P72在SEA、SEB和SEC2中的同源序列結構圖中可以看出，P72在SEA、SEB和SEC的同源序列在空間結構具有高度的相似性。

2.5多肽P72在TCRVβ-SEB-MHCⅡ空間結構中的位置結果顯示，在TCRVβ-SEB-MHCⅡ三分子相互作用的空間結構中，P72遠離SEB的TCR和MHCⅡ結合位(圖3)，圖4示P72在SEB空間結構中的位置。

3討論

金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxin，SE)是一類由金黃色葡萄球菌(Staphylococcal aureus)產生的蛋白質，均為超抗原分子，其引起的疾病譜非常廣泛，毒性休克綜合征、多器官功能障礙綜合征、食物中毒、Kawasaki綜合征、多發性脈管炎、哮喘等多種疾病與SEs超抗原有

關[4-9]。因此針對SEs設計廣譜抑制性多肽，有望成為SEs相關疾病免疫防治的新手段。在前期的研究中，我們從SEs保守的同源氨基酸序列篩選出了一條廣譜抑制性多肽P72，能顯著抑制SEA、SEB、SEC三種超抗原促人PBMC增殖活性[3,10]。多肽P72能夠顯著抑制SEA、SEB和SEC的促PBMC增殖活性，顯示了其廣譜的抑制作用。多肽P72的氨基酸序列DLADKYKDKYVDVFG來源于超抗原SEB 的72~86位氨基酸殘基序列，這些序列位于SE家族中的同源保守部分，序列對比分析顯示SEA、SEB、SEC1和SEC2的72~86位氨基酸殘基序列同源性較高，與SEA的同位置的氨基酸序列相比，在15個氨基酸殘基中有9個相同，對于SEC1和SEC2則分別有10個和11個相同。空間結構比對可以看出，SEA、SEB和SEC2所對應的72~86位氨基酸序列的在空間結構非常相似。國外的研究也表明SEB的76~86位氨基酸序列在SE家族中不僅顯示了序列的同源性，同時也顯示了空間的保守性[11]。因此P72能夠拮抗3種超抗原，顯示其廣譜抑制性。在前期研究的細胞模型結果顯示，P72能明顯抑制SEA、SEB、SEC刺激PBMC分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β，隨多肽的劑量增加而抑制作用增強，并可能為競爭抑制作用[3]，競爭結合實驗結果顯示P72對SEs的抑制作用可能不是與MHC Ⅱ類分子結合產生的。這與國外研究結果相反[12]，這可能是純化、修飾應用于合成P72過程中，其空間結構和性質可能發生了變化[10]。

國外研究者Jett等[13]認為其設計的多肽與SEs的氨基酸序列中參與調節T細胞增殖的某些保守區域結合而發揮抑制作用。Arad[12,14]沒有做相關的實驗，因此不清楚其設計的多肽P12是與MHC Ⅱ類分子還是TCRVβ鏈結合。Visvanathan等[15]研究了多肽6343的結合位點，利用人HLA-DR-1的ELISA結合試驗研究了該肽分子與MHC Ⅱ類分子的結合活性，結果顯示多肽6343與MHC Ⅱ類分子具有很高的親和活性，表明此肽與SE競爭結合PBMC的MHC Ⅱ類分子的結合位點而發揮廣譜抑制作用。

超抗原能夠繞過主要組織相容性復合體的限制以及細胞內抗原加工和提呈，直接與MHCⅡ類分子和TCR分子結合[16]。國外研究利用SEB與MHCⅡ類分子和TCR分子相互作用的三分子空間模型，研究設計的抑制性多肽的抑制活性功能，已經有研究顯示了SEs家族的TCR的結合位點，如SEB的氨基酸序列81~93可能是TCR分子的結合位點[12,16,17]。P72的氨基酸序列來源于超抗原SEB的72~86位氨基酸序列，其中81~86位殘基部分地涉及801~93序列，有可能與TCR分子結合，但在TCRVβ-SEB-MHCⅡ三分子相互作用的空間結構圖中，我們看到，P72遠離SEB的TCR和MHCⅡ結合位，這表明SEB上的P72這段氨基酸序列可能既不與MHC也不與TCR結合，由于研究條件限制，P72與TCR結合的實驗未能進行，因此P72是否與TCR結合無法確定。

除了與MHC 和 TCR 結合產生抑制作用外，抑制性多肽還可能通過與 T 細胞或APC 上的受體結合誘導多肽適應并模擬SEs超抗原分子上的對應區域產生競爭抑制作用。如通過影響超抗原功能的協同刺激分子 (如 CD28/B7 和細胞毒性 T 細胞抗原 4/B7 等)之間的相互作用而發揮抑制作用，P72 的抑制效應是否為上述抑制途經，有必要在將來的研究中探討[10,12,14]。 綜上，本研究運用同源建模的方法，對P72的SEs廣譜抑制機制進行了研究，發現多肽P72不與MHC結合，可能也不與TCR結合，其具體的抑制機制有必要在今后的研究中進行探索，本研究可為SEs相關疾病的免疫防治提供線索和手段。

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[收稿2015-07-25修回2015-08-21]

(編輯許四平)----------------------------------------------

Study on design and three-dimension structure of a broad-spectrum inhibitory peptide against staphylococcal enterotoxins superantigen

WANGSi-Xiong，MAHui-Wen，WANGDong-Lin.ChongqingTumorInstitute,Chongqing400030,China

[Abstract]Objective:Peptides were designed on the basis of high conservative regions of amino acid sequences and structures of the SEs,three-dimension structure of P72 was constructed.Methods: Bioinformatics analysis softwares such as Vector NTI 10.3，InsightII 2000,Discovery Studio 1.7 were used to analyse and predict the space structure of P72.Results: three-dimensional domains of the peptide P72 from SEA,SEB and SEC were quite similar,Peptide P72 was far away from TCRVβ chain and MHC class II molecule.Conclusion: The inhibitory activity of peptide P72 may not due to binding to MHCⅡ and TCRVβ chain.The exact mechanism of inhibitory activity of P72 should be explored.

[Key words]Staphylococcal enterotoxin;Superantigen;Synthetic peptide

作者簡介：王思雄(1973年-)，男，博士，主治醫師，主要從事腫瘤免疫、分子免疫學方面的研究，E-mail:154055617@qq.com。

通訊作者①，E-mail:donglinw@21cn.com。

中圖分類號R392.11

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0197-04