慢性間歇性低氧動物模型的比較

馬林沁，張京春，劉　玥

(中國中醫科學院 1.西苑醫院心血管病中心，2. 心血管病研究所，北京　100091)

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慢性間歇性低氧動物模型的比較

馬林沁1,2，張京春1,2，劉玥1,2

(中國中醫科學院 1.西苑醫院心血管病中心，2. 心血管病研究所，北京100091)

摘要：阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)導致的慢性間歇性低氧(CIH)是引起或加重多種心腦血管病的重要病理因素。建立CIH動物模型，通過控制動物呼吸的環境氣體氧濃度的方法模擬間歇性低氧條件，是研究CIH相關心血管疾病發病機制的重要方法之一。該文從實驗動物、氣體控制儀器、氣體種類及濃度、間歇性低氧處理時間、缺氧循環模式等方面總結及對比了近年來CIH動物模型的造模方法，以求為OSAHS相關心血管疾病的動物實驗研究提供參考。

關鍵詞：動物模型；間歇性低氧；阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征；心血管疾?。桓哐獕海粍用}粥樣硬化

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)在人群中具有較高的患病率[1]，被認為是心血管疾病的獨立危險因素[2-3]，它能夠增加高血壓、腦卒中、冠心病、心力衰竭及心源性猝死等心腦血管疾病及事件的風險[4-6]，因而其與心血管病關系近年來日益受到研究者的關注。OSAHS以慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)為核心病理特征，表現為睡眠中長期并反復出現缺氧-復氧，CIH是OSAHS導致心腦血管并發癥的主要因素。針對這一核心特征，近年來，許多研究以動物為實驗對象，通過手術控制動物氣道通氣或體外調節動物呼吸的環境氣體氧濃度等方法，模擬間歇性低氧條件以實現反復的缺氧-復氧過程來模擬人類OSAHS的表現，因此，建立間歇性低氧動物模型是研究OSAHS相關疾病的重要方法。

近20年來，對于CIH相關心血管疾病的動物實驗研究眾多，造模方法不一，選材及處理條件各不相同，尚無公認的動物模型。通過檢索近年來研究CIH相關心血管疾病及CIH對心血管病常見危險因素影響的文獻，本文將對其中慢性間歇性低氧動物模型的建立方法進行歸納整理，并探討其規律，以求為OSAHS相關心血管疾病的動物實驗研究提供參考。

1實驗動物的選擇

1.1動物的種類OSAHS模型動物種類繁多，早期研究常采用大型哺乳動物，如英國斗牛犬[7]、小型豬[8-9]等，而近年用于CIH相關心血管疾病研究的動物模型以嚙齒類動物為主，主要包括大鼠、小鼠。其中大鼠又包括Sprague Dawley(SD)大鼠[10]、Wistar大鼠[11]等，小鼠常用C57BL/6J小鼠[12-13]等，其他研究者也曾選用豚鼠[14]，非嚙齒類動物如新西蘭大耳白兔[15]等。

在這些分類的基礎上，根據不同實驗研究的需求，特別是以某一信號通路或某種特定疾病為具體研究內容的實驗中，基因敲除動物、突變系動物及自發性疾病動物的應用也非常廣泛。基因敲除動物最多見的是載脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠，最常用于動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)相關的研究中[16-17]；又如在一項關于缺氧相關炎癥反應中核轉錄因子kappa B(NF-κB)作用的研究中，應用了敲除NF-κB抑制蛋白IκB的激酶IKK-β的小鼠[18]。常用突變系動物如肥胖自發突變的純合子小鼠(ob/ob小鼠)，它常被用于間歇性低氧相關肥胖及血脂代謝異常研究[19]。自發性疾病動物以自發性高血壓大鼠(spontaneous hypertension rat, SHR)[20]為代表，主要用于間歇性低氧合并高血壓的研究。

縱觀目前間歇性低氧動物研究，大鼠、小鼠仍為主要的模型動物，究其原因，主要源于它們的晝夜習性規律，晝伏而夜動，睡眠時間與人的工作時間較吻合，適于睡眠疾病的研究。另外，考慮造模過程中動物缺氧箱等設備的空間需求，大鼠、小鼠體積較小，更方便操作。

1.2動物的其他特性選定某種動物為研究對象后，其他如性別、周齡等生物學特性也需納入考慮范圍。但從目前的眾多研究來看，這些特性的選擇與其他各種常見心血管疾病的模型動物并無差異。

在動物性別的選擇上，多數研究傾向于選用♂動物[21]，以盡量避免激素分泌水平、妊娠等因素的干擾。而在對比性別間差異或其他特殊情況下也會選用♀動物，如曾有研究[22]觀察了間歇性低氧條件下♀、♂ SD大鼠間血壓變化差異，結果提示兩種性別大鼠在間歇性低氧條件下都會產生血壓升高的效應，但♀大鼠血壓升高水平低于♂及卵巢切除術后的♀大鼠；近年又有研究者[23]對比了間歇性低氧對不同性別C57BL/6J小鼠間血管壁蛋白表達影響的差異，發現♀與♂小鼠相比，20種蛋白表達上調，14種蛋白表達下調，其中上調的蛋白中包括了APOA-4等血脂代謝相關蛋白，而下調的蛋白以NACHT等炎癥相關蛋白為主。再如一項研究間歇性低氧對機體瘦素分泌影響的研究中，也選用了瘦素水平較高的♀小鼠以便于指標檢測及比較[24]。

在周齡的選擇上多選用成年動物，大鼠多選用8～10周齡[25-26]，而小鼠通常選擇7～12周齡[12，16]。在某些對特殊年齡人群間歇性低氧的研究中也有例外，如在一項建立兒童OSAHS間歇性低氧動物模型的研究中就采用了僅有25d齡的SD大鼠[27]；另有一項比較慢性間歇性低壓低氧對于成年和幼年大鼠缺血/再灌注心臟保護作用研究中，選擇新生大鼠作為觀察對象，結果提示幼年大鼠更易對低氧耐受[28]。

2氣體控制儀器的選擇

在模擬間歇性低氧條件的氣體控制儀器選擇方面，不同研究之間差別較大。部分研究者從相關的儀器公司購買專用于動物低氧研究的成品儀器，也有部分研究者則選擇自制儀器或相應的替代產品。

專用于低氧動物實驗的氣體控制儀器的優點是能夠通過計算機編程預設所需的不同氧濃度，自動選擇注入氧氣提高氧濃度或注入其他氣體降低氧濃度，控制條件較準確、處理條件相對穩定；并具備數據記錄、實時顯示和遙控等功能。這種氣體控制儀器通常配有相應的缺氧動物箱以適應和保證調控氣體濃度的要求，并配有相應的氧濃度檢測裝置。典型的儀器例如OxyCyler model A84 system[29-31]，產自美國Biospherix公司。也有許多實驗室及研究者選擇與成品儀器功能類似的其他低氧設備，同時使用配套的或自制的缺氧動物箱[32]，多數發表論文中對這種儀器描述欠具體。也有少數研究不使用缺氧動物箱，而使用改裝的動物鼻面罩通入缺氧及復氧氣體[33]。

雖然氣體控制儀器各種各樣，但是其原理相似。這些儀器都需要配備密閉的缺氧箱、氧濃度檢測裝置等必要組件，事實上，只要能夠實現較為迅速的氣體轉換、保持實驗需要的穩定的氣體濃度即可。

3氣體種類及濃度的選擇

3.1缺氧及復氧氣體實驗過程中，制造低氧環境多選用通入氮氣[12,19]以迅速降低氧濃度，也有少數研究選用氮氣與二氧化碳的混合氣體[34]。而對于復氧氣體的選擇，則有氧氣[35-36]、空氣[19,37]等不同。此外，尚有研究[28]將氮氣與氧氣進行2種不同比例混合，分別使其氧濃度為最低氧濃度與常氧濃度，分別用于低氧條件及常氧條件的模擬。

目前尚無明確證據表明氮氣或混合缺氧氣體對模型動物有何不同影響，目前的研究多關注于造模所需的最低氧濃度，對于氮氣、氧氣、二氧化碳等常規缺氧及復氧氣體種類的選擇則缺乏明確的解釋。

3.2最低氧濃度常氧條件均與空氣氧濃度近似，約為20.9%；但文獻所示最低氧濃度的范圍則較大，通常在5%～10%之間。如Del Rio R等[38]在頸動脈體對間歇性低氧的化學反射的研究中，就將最低氧濃度設置為5%，而在一項研究間歇性低氧對高血壓影響的研究中最低氧濃度則設定為10%[22]。部分間歇性低氧動物研究中的最低氧濃度并非一個固定值，而是一個較小的范圍，如一項關于CIH與AS的研究中最低氧濃度設定在6.0%～6.5%范圍內[39]。

在間歇性低氧的干預下，不同研究中所形成的疾病終點或病理終點有血壓變化、AS、炎癥反應、細胞凋亡或損傷等不同。在證明不同最低氧濃度在形成這些終點間的差異方面文獻報道較匱乏，曾有學者[40]比較最低氧濃度分別為5%、7.5%、10%條件下間歇性低氧對大鼠血清白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)水平的影響，發現最低氧濃度為5%時比為10%時IL-8水平高(P<0.05)，說明了不同最低氧濃度間歇性低氧對炎癥反應的影響不同；但總體來說目前仍無研究為最低氧濃度的選擇提供確切、有力的證據。比較實驗目的相似卻選擇不同最低氧濃度的研究來看，在5%～10%范圍內，造模結果差異并不明顯，已發表文獻中鮮有介紹最低氧濃度選擇依據者，而同一研究者或同一研究團隊常選用相同的最低氧濃度[38,41]?？紤]研究者之所以選擇不同，可能與經驗、儀器條件限制等因素有關。

4間歇性低氧處理時間的選擇

為了更近似地模擬人的慢性睡眠呼吸暫停過程，需要每日重復間歇性低氧操作、連續處理實驗動物一段時間，并盡量與動物的睡眠時間吻合。

4.1連續處理天數這是不同研究造模的主要差別之一，根據文獻可見研究處理天數多在28 d(4周)～84 d(12周)之間[35,42-44]。有研究者[45]模擬CIH條件連續處理C57BL/5J小鼠12周，在合并高膽固醇飲食條件下，發現與正常氧相比，間歇性低氧干預可導致胰島素敏感性下降、糖脂代謝異常及AS改變。同樣是CIH相關AS研究，有學者[35]將ApoE基因敲除小鼠分別暴露于CIH環境4周和12周，結果顯示實驗性CIH暴露無論是在第4周還是在第12周均可以明顯促進小鼠主動脈AS斑塊的形成，同時觀察到4周時小鼠的收縮壓升高，12周時舒張壓亦升高。

也有少數間歇性低氧研究的缺氧處理時間明顯長于12周或短于4周。如另有一項觀察NF-κB激活對CIH相關主動脈粥樣硬化斑塊形成過程中的作用研究中，研究者采用了較長了處理周期，共計20周(140 d)，結果提示CIH合并高脂飲食可引起血管壁炎癥反應和明顯的AS斑塊形成，在這一過程中NF-κB的激活是重要的機制[39]。而研究間歇性低氧對血壓水平影響的眾多研究中，處理周期則較短，常為14 d[46]，尚有短至7 d者[22]。

分析處理天數不同的原因，可能與以下幾個因素相關：① 目標心血管疾病模型的要求：根據目前文獻報道，間歇性低氧處理較短時間可見血壓升高[47]、炎癥反應增強[38]、細胞凋亡加速[48]等效應，而處理時間較長除上述效應外較多的研究觀察到血脂異常[19]、血管內皮損傷及AS形成[35]等。但目前尚無較完備的研究為這種效應的演變提供明確的依據，有待進一步探索。② 動物本身特性的不同：通過比較部分研究可見，健康動物對缺氧的耐受力可能強于一些基因缺陷的動物，處理天數較多；而基因缺陷動物則可能處理天數較少，即其出現間歇性低氧相關病理表現較早，如ApoE基因敲除小鼠[49]在CIH和高脂飲食聯合誘導下可以較早地表現出AS病理變化。此外，根據具體實驗的不同，CIH處理天數選擇還可能與研究者經驗、實驗條件限制等因素有關。需要注意的是，文獻提示嚙齒類動物在低氧干預的初期可能出現一定程度的體重下降[34,50]，但又有相關的研究[51]表明這種體重變化與缺氧程度不同相關且在后期可以恢復。因此，若進行間歇性低氧相關體重、血脂與血糖代謝等與心血管疾病危險因素關系密切的指標觀察，在選擇間歇性低氧處理時間時應考慮這一因素。

4.2日處理時間相關研究通常都采用每日某一時間段連續進行間歇性低氧處理實驗動物。大鼠、小鼠的晝夜節律較明顯，為晝伏夜動，人的工作時間恰與它們的睡眠時間相吻合，因此通常都選擇白晝8:00～18:00中的某一時間段連續間歇性低氧處理8 h[52-53]；也有少數研究日處理時間可達12 h[54-55]。

5缺氧循環模式的選擇

區別于持續性低氧，間歇性低氧以缺氧-復氧反復循環為特點，模擬這一循環模式是間歇性低氧動物模型建立的關鍵步驟。缺氧循環模式包括每一缺氧-復氧循環時長、由常氧降至最低氧濃度所用時間、維持最低氧濃度時間、復氧所用時間等，這是不同間歇性低氧動物模型研究的最大差異所在，幾乎每一個研究都有不同的缺氧循環模式。根據缺氧達到最低氧濃度后是否維持一段時間可分為氧濃度漸變模式和最低氧濃度維持模式兩類：

5.1氧濃度漸變模式指在一定時間內將氧濃度降到實驗要求的最低氧濃度，然后立即復氧(如Fig 1A)，這種模式中由常氧降至最低氧濃度所用時間與復氧所用時間通常相等。最常見的是1 min間歇性低氧循環周期中，前30 s降至最低氧濃度，后30 s逐漸復氧[35,56]；也有如Alba Carreras等的研究[12]將缺氧和復氧時間分別設置為90 s。

A: FIO2gradient mode; B: Nadir FIO2maintaining mode;FIO2: Fraction of inspiration O2, t: Time

5.2最低氧濃度維持模式指在一定時間內將氧濃度降到實驗要求的最低氧濃度，維持最低氧濃度一段時間，然后復氧(如Fig 1B)，這種低氧持續一段時間的模式能更類似于人的睡眠呼吸暫停。采用這種模式的研究之間每一缺氧循環周期長度不等，周期中缺氧持續的時間也不等[31,39,57]。有研究者[16]觀察間歇性低氧對SD大鼠血壓的影響，選擇的缺氧循環模式以6 min為一個周期，在1 min內達到最低氧濃度10%，保持最低氧濃度2 min，后3 min轉為常氧。另有研究[39]觀察間歇性低氧相關AS，選擇1 min為一個缺氧循環周期處理C57BL/6J小鼠，在前30 s內降到最低氧濃度6.0%～6.5%并保持5～7 s，后30 s復氧；一項觀察OSAHS大鼠脂肪因子vaspin與胰島素信號通路關系的研究中也采用的這種缺氧循環方式[58]。有學者[59]在研究間歇性低氧過程中炎癥反應的發生時，以SD大鼠為實驗對象，以120s為缺氧循環周期，將氮氣快速充入低氧艙使氧濃度降到最低氧濃度8%，維持30 s，然后快速充入純氧使氧濃度上升達常氧，維持30 s，結果發現間歇性低氧促進炎癥因子白介素-1(IL-1)的釋放。

國內有研究者對不同缺氧循環模式的間歇性低氧動物模型進行比較，將各組SD大鼠的缺氧循環中低氧時間、常氧時間、最低氧濃度分別設置為，45 s、45 s、10%，30 s、30 s、10%，30 s、30 s、5%，通過測量動脈氧分壓(PO2)及氧飽和度(SaO2)發現，以上3組PO2及SaO2均低于常氧對照組(P<0.05)，且3組間比較PO2及SaO2依次降低(P<0.05)，成功通過這3種模式分別模擬輕、中、重度OSAHS[60]。目前尚無研究同期比較氧濃度漸變模式與最低氧濃度維持模式對間歇性低氧動物模型的影響有何明確差異，沒有證據證明何種模式成模率更高或模型更穩定，有待于進一步研究完善。

6小結與展望

OSAHS相關動物模型有多種類型，如自發動物模型、手術動物模型及非手術動物模型等[61]。CIH在OSAHS導致心血管病的發生過程中扮演了非常重要的角色，目前研究都傾向于非手術方法，控制環境空氣的氧濃度形成缺氧-復氧循環，以模擬CIH過程，這種方法簡單易操作，便于相關研究廣泛應用。目前造模方法主要的不同之處在于缺氧循環模式，其次為缺氧處理天數、動物種類的選擇?？偟膩碚f，間歇性低氧動物模型主要選用成年♂嚙齒類動物(大鼠、小鼠)，選用能夠自動控制氣體輸入、轉換的儀器設備，配套使用密閉性良好的動物培養箱、氧濃度檢測設備，通過輸入氮氣、氧氣、空氣等不同氣體改變培養箱內的氧濃度，使其在5%～10%至空氣氧濃度間規律循環變化，每日處理8～12 h，連續處理約4～12周，可能能夠觀察到血壓升高、炎癥反應、血管內皮損傷、胰島素敏感性降低、動脈斑塊形成等心血管病理變化，從而用于CIH相關心血管疾病的研究。需要注意的是，目前研究表明，在高脂飲食條件下，CIH可加速AS的形成，但其是否能夠獨立介導AS的形成仍有待研究。

自1992年Fletcher等[62]首次報道通過CIH大鼠模型研究CIH與高血壓關系以來，CIH相關心血管疾病的動物研究已有20余年，目前仍屬于研究的熱點之一。無論是CIH動物模型本身還是相應的治療方法都處于探索階段，尚有較大的研究空間。目前文獻報道的各種CIH造模方法在氧濃度、缺氧氣體選擇、處理周期等許多細節方面存在較多差異，新的研究多根據文獻或既往經驗設計造模方案，仍期待出現更可靠的研究為間歇性低氧動物模型的規范化提供實證依據。

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Research progress of chronic intermittent hypoxia animal models

MA Lin-qin1,2, ZHANG Jing-chun1,2, LIU Yue1,2

(1.CardiovascularDiseasesCenter,XiyuanHospitalofChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China;2.ChinaHeartInstituteofChineseMedicine,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China)

Key words:animal models; chronic intermittent hypoxia(CIH); obstructive sleep apnea hypopnea syndrome(OSAHS); cardiovascular diseases; hypertension; atherosclerosis(AS)

Abstract:Chronic intermittent hypoxia(CIH) caused by obstructive sleep apnea hypopnea syndrome(OSAHS) is an important factor causing or aggravating many kinds of cardiovascular and cerebrovascular diseases. Establishing a rational animal model for intermittent hypoxia is an essential method to study the CIH related cardiovascular diseases. Recently, researchers have tended to simulate intermittent hypoxia condition by controlling the oxygen concentration of the environmental air around the animals. In the paper, we summarize and compare the methods of making intermittent hypoxia animal model in recent literature, from aspects of experimental animals, gas control apparatus, gas species and concentration, intermittent hypoxia treatment time, and anoxic cycle mode.

收稿日期：2015-11-04，修回日期：2016-02-28

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81373825,81573817,81403266);國家中醫臨床基地行業專項課題(No JDZX2012108)

作者簡介：馬林沁(1989-)，女，博士生，住院醫師，研究方向：間歇性低氧與心血管疾病，E-mail：mlqmlq818 @163.com； 張京春(1965-)，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：間歇性低氧與心血管疾病，通訊作者，E-mail：zhangjingchun276@vip.sohu.com； 劉玥(1982-)，男，博士，主治醫師，研究方向：間歇性低氧與動脈粥樣硬化，通訊作者，E-mail：liuyueheart@yahoo.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.001

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0445-06

中國圖書分類號：R-332；R363-332；R563.8；R845.22

網絡出版時間：2016-3-18 11:22網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.002.html

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