芪藶強心膠囊對慢性心衰大鼠下丘腦室旁核RAS系統及交感神經系統的影響

馬柳一，尹玉潔，張軍芳，劉　煥1,，賈振華

(1.河北醫科大學研究生學院，河北 石家莊　050017; 2.河北以嶺醫藥研究院，國家中醫藥管理局重點研究室(心腦血管絡病)，河北 石家莊　050035; 3.河北醫科大學附屬以嶺醫院心血管科(國家中醫藥管理局中醫絡病學重點學科)，河北 石家莊　050091)

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芪藶強心膠囊對慢性心衰大鼠下丘腦室旁核RAS系統及交感神經系統的影響

馬柳一1,2,3，尹玉潔1,2,3，張軍芳2，劉煥1,2，賈振華1,3

(1.河北醫科大學研究生學院，河北 石家莊050017; 2.河北以嶺醫藥研究院，國家中醫藥管理局重點研究室(心腦血管絡病)，河北 石家莊050035; 3.河北醫科大學附屬以嶺醫院心血管科(國家中醫藥管理局中醫絡病學重點學科)，河北 石家莊050091)

摘要:目的觀察經側腦室長期泵入芪藶強心膠囊對慢性心衰大鼠心功能、下丘腦室旁核內腎素-血管緊張素系統(RAS)血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)、血管緊張素轉換酶(ACE)、血管緊張素Ⅰ型受體(AT1R)及外周交感神經活性的影響。方法采用結扎冠狀動脈左前降支建立急性心肌梗死致心衰模型，造模4周后，經側腦室插管連接微量注射泵，分別給予醇化芪藶強心溶液和陽性藥氯沙坦，給藥4周后，應用超聲心動圖測定各組大鼠心功能變化，HE染色觀察心肌組織形態，酶聯免疫法測定血漿去甲腎上腺素(NE)、血清N端前腦鈉肽(NT-proBNP)及室旁核內Ang Ⅱ含量變化，Real-time PCR和Western blot方法測定室旁核ACE、AT1R mRNA及蛋白表達水平，PowerLab多通道生理記錄儀測定各組腎交感神經活性的變化。結果與假手術組比較，模型組大鼠心功能明顯降低，下丘腦室旁核內Ang Ⅱ、ACE、AT1R表達水平及NE、NT-proBNP表達水平明顯升高，腎交感神經放電活性增強；與模型組比較，各給藥組均可不同程度改善心衰大鼠心功能，減輕心肌組織形態改變，降低下丘腦室旁核Ang Ⅱ、ACE、AT1R及NE、NT-proBNP表達水平，降低腎交感神經放電活性。結論經側腦室連接微量注射泵給予芪藶強心膠囊可降低下丘腦室旁核內RAS系統的激活，降低腎交感神經的活性，改善慢性心衰大鼠心功能，延緩心衰的進展。

關鍵詞:芪藶強心膠囊；慢性心衰；下丘腦室旁核；腎素-血管緊張素系統；交感神經；大鼠

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是心臟泵血功能障礙與代償性激活的神經體液因子相互作用為特征的臨床綜合征。交感神經系統異常激活的中樞機制成為近期心衰研究的熱點。腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensinsystem，RAS)廣泛分布于中樞各個神經核團，研究發現，側腦室[1]、下丘腦室旁核(paraventricular nucleus of hypothalamus，PVN)[2]等部位微量注射血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)可以增加CHF大鼠的腎交感神經活性，這表明中樞RAS系統的激活是促進交感神經活性增強、加重心衰進展的一個重要因素。芪藶強心膠囊是運用中醫絡病學說研制的中藥復方制劑，基礎和臨床研究發現，其具有抑制神經內分泌過度激活、抑制RAS系統、抑制心室重構功效，但其對中樞RAS系統及腎交感神經活性的影響尚不明確。本實驗采用微量注射泵，經慢性心衰大鼠側腦室給予醇化芪藶強心溶液4周，并采用氯沙坦作為陽性對照，觀察慢性心衰大鼠PVN內RAS系統及腎交感神經活性的變化及中藥芪藶強心對其的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物成年♂ SD大鼠，90只，8周齡左右，體質量200～220 g, SPF級別，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[編號SCXK(京)2012-0001]。飼以標準飼料，自由進食飲水，光照12 h·d-1，溫度(20～23) ℃，相對濕度40%～60%。

1.1.2藥物和試劑中藥復方芪藶強心膠囊(石家莊以嶺藥業股份有限公司)，經藥學方法醇化芪藶強心膠囊粉，溶于人工腦脊液，配制濃度為10 g·L-1和20 g·L-1的溶液[3]；人工腦脊液(湖北英創生物科技有限公司，批號：2015041901)；陽性藥氯沙坦(TCI，批號：L0232)；ACE小鼠抗大鼠單克隆抗體(Abcam，批號：ab11734)；AT1R兔抗大鼠多克隆抗體(Abcam，批號：ab18801)；大鼠Ang Ⅱ、NE、NT-proBNP酶聯免疫吸附試劑盒(CUSABIO ，批號：E07301r；N10136373；M21136229)。

1.1.3儀器MyLab Five VET(意大利百勝ESAOTE)；HX-300動物呼吸機 (成都泰盟科技有限公司)；腦立體定位儀(淮北正華生物儀器有限公司)；BL-420E生物機能實驗系統( 成都泰盟科技有限公司)；ZH-RXZ型柔性顱骨鉆(淮北正華生物儀器有限公司)；微量注射泵(DURECT公司)；PowerLab信號采集系統(Ad Instruments)；DP301生物電放大器(Warner Instruments)。

1.2方法

1.2.1模型建立及側腦室給藥心衰模型的建立：大鼠腹腔注射麻醉(體積分數為0.1的水合氯醛3.5 mL·kg-1)，經口氣管插管連接小動物呼吸機(潮氣量30～32 mL,呼吸比1 ∶2，呼吸頻率90次·min-1)。開胸暴露心臟，待大鼠心電、呼吸平穩后，輕輕撥開左心耳，于左心耳下距主動脈根約1.5 mm處結扎左冠狀動脈前降支(假手術組只穿線不結扎)，術后分層縫合胸壁，留置插管排氣，關閉胸腔。待大鼠恢復自主呼吸后，拔出氣管插管，腹腔注射青霉素，放入籠中正常飼養。

植入微量注射泵經側腦室給藥：大鼠左冠狀動脈前降支結扎4周后，將其麻醉，并以水平俯臥的姿勢置于盒子的上方，固定在立體定位儀上，確定微量注射泵導管的安置位置(前骨縫的交點處，即沿著前囟中骨縫向前約1.5 mm，水平離中骨縫向右約1.5 mm位置)，使用立體定位儀在微量注射泵導管安裝位置上打孔。將導管安裝在孔內，導管慢慢的伸入側腦室[4]，并用專用膠水固定。導管的另一端連接已裝入藥的微量注射泵，將微量注射泵埋在大鼠頸部皮下，縫合切口。

1.2.2實驗分組造模4周后，根據超聲心動圖和心電圖，采用EF<42%作為評定心力衰竭的標準[5]篩選成模動物，并用隨機數字法進行分組：模型組(CHF+VEH)、陽性藥組(CHF+Losartan,10 mmol·L-1)、芪藶強心溶液低劑量組(CHF+QLQX-L)、芪藶強心溶液高劑量組(CHF+QLQX-H)。另設正常對照組(Normal)和假手術組(Sham+VEH)。每組15只。假手術組和模型組給予人工腦脊液，陽性藥組給予氯沙坦(AT1R阻滯劑)，芪藶強心溶液低、高劑量組給予經醇化芪藶強心溶液，分別經側腦室連接注射泵連續給藥，給藥量0.25 μL·h-1，給藥周期4周。

1.2.3大鼠心功能的測定給藥4周后，超聲測定大鼠心功能，每組取9只大鼠腹腔麻醉注射后進行超聲心動圖檢測，取胸骨旁左室長軸和乳頭肌水平短軸切面。檢測指標包括左室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic dimension，LVDd)、左室收縮末期內徑(left ventricular end systolic dimension，LVDs)、左室舒張末期容積(left ventricular end diastolic volume，LVVd)、左室收縮末期容積(left ventricular end systolic volume，LVVs)、射血分數(ejection fractions，EF)和短軸縮短率(fractional shortening，FS)；將大鼠取下心臟及肺臟稱重，心重和肺重與大鼠體重的比值即為心重指數(heart weight/body weight，HW/BW)和肺重指數(lung weight/body weigh，LW/BW)。

1.2.4心肌組織HE染色取出心臟，沿左室橫徑最大的部分切取約0.2 cm厚度組織，固定于4%多聚甲醛溶液中24 h，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，沿心臟冠狀面連續切片，厚4 μm，HE染色。

1.2.5大鼠血漿NE、血清NT-proBNP及下丘腦室旁核Ang Ⅱ含量的測定采用腹主動脈采血，抗凝處理，4 ℃，3 000 r·min-1，離心15 min，分別取上清于EP管中，-80 ℃冷凍保存備用。大鼠斷頭、取腦后依據大鼠腦定位圖譜于PVN區域打孔，提PVN，以一定的比例加PBS緩沖液研磨，-80 ℃冷凍保存備用。ELISA法測定NE、NT-proBNP及Ang Ⅱ水平，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.6Western blot測定PVN內ACE、AT1R蛋白含量的表達取PVN組織，加入細胞裂解液，冰浴勻漿，充分裂解20 min，4 ℃，8 000 r·min-1離心10 min，收集上清進行蛋白定量。隨后進行電泳、轉膜、封閉，一抗、二抗孵育，抗體結合區帶用化學發光法檢測。

1.2.7Real-time PCR測定PVN內ACE、AT1R mRNA含量的表達取PVN組織，加TRIzol于冰浴勻漿器中，提取組織總RNA，并對RNA純度與完整性進行檢測，完整性好及蛋白污染較少可準備后續反轉錄反應。逆轉錄-聚合酶鏈反應：逆轉錄cDNA的合成，取總RNA置于反轉錄反應液液中反轉錄50 min，95℃ 5 min滅活反轉錄酶；引物合成：ACE(76 bp)：上游5′-CACCGTTACCAGACAACTATCC-3′，下游5′-TCCTCCACGAACCTGTTAGC-3′；AT1R(68 bp):上游5′-TCGGCAATCACCTATGTAAG-3′，下游5′-AAGGAACACACTGGCGTAG-3′；GAPDH(120 bp)：上游5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游5′-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3′。PCR熱循環參數：首次96℃ 4 min，然后經94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s三步，共進行40個循環，于每個循環第3步72℃ 30 s時收集熒光信號。

實時熒光定量PCR結果分析：擴增完畢后進入

**P<0.01vsSham+VEH;#P<0.05,##P<0.01vsCHF+VEH

到結果分析界面，以GAPDH作為內參照基因，與對照組相比較，獲得目的基因表達相對定量值(RQ值)作為統計分析。

1.2.8大鼠腎交感神經放電的變化每組實驗大鼠隨機抽取6只，腹腔麻醉后，將大鼠固定于手術臺上，鈍性分離組織，暴露左側股靜脈，順血管走向鈍性分離，行左側股靜脈插管以靜脈給藥。動物取右側臥位，經腰部縱行切口沿腹膜后路徑暴露左側腎臟，在解剖顯微鏡下找到左側腎動脈和腎神經，分離腎交感神經，掛于雙極珀金絲銀絲電極，滴加37℃石蠟油保存濕潤，接生物電放大器，PowerLab生物信號系統采集信號。記錄完后靜脈注射硝普鈉(100 μg·kg-1)[6]，以誘導交感神經放電(renal sympathetic nerve activity，RSNA)的最高峰。將基礎放電與硝普鈉誘導的最高放電值之比作為統計學數據，對各組間RSNA活動情況進行比較。

2結果

2.1各組大鼠心功能的變化結果顯示，與Nomal組相比，Sham+VEH組心功能各參數無統計學差異；與Sham+VEH組比較，CHF+VEH組LVDd、LVDs、LVVd、LVVs、HW/BW、LW/BW升高(P<0.01)，EF、FS降低(P<0.01)；與CHF+VEH組比較，CHF+ Losartan組、CHF+QLQX-H組LVDd、LVDs、LVVd、LVVs、HW/BW、LW/BW降低(P<0.01)，EF、FS升高(P<0.01)，CHF+QLQX-L組LVDs、LVVs、HW/BW、LW/BW降低(P<0.05)，EF、FS升高(P<0.01)，以CHF+ Losartan組、CHF+QLQX-H組最為明顯(Tab1)。

2.2各組大鼠心肌組織病理結果比較Nomal組、Sham+VEH組心肌組織細胞核成藍色，心肌肌束飽滿、細胞質成紅色，未見心肌纖維化和炎性細胞浸潤現象。CHF+VEH組梗死區心肌組織著色淡，心肌細胞數量減少，心肌纖維化嚴重，梗死灶及周圍有大量炎性細胞浸潤。各治療組損傷程度減輕，心肌細胞數目增加，心肌組織纖維化程度減輕，炎性細胞數目減少(Fig 1)。

A:Normal; B:Sham+VEH;C:CHF+VEH;D:CHF+Losartan;E:CHF+QLQX-L;F:CHF+QLQX-H

2.3各組大鼠NE、NT-proBNP、Ang Ⅱ含量的結果比較結果顯示，與Nomal組比較，Sham+VEH組血漿NE、血清NT-proBNP、PVN內Ang Ⅱ含量差異無統計學意義；與Sham+VEH組比較，CHF+VEH組NE、NT-proBNP、Ang Ⅱ含量均明顯增加(P<0.01)；與CHF+VEH組相比，CHF+Losartan組、CHF+QLQX-L組、CHF+QLQX-H組均可不同程度的降低血漿NE、血清NT-proBNP、室旁核Ang Ⅱ含量(Tab2)。

2.4各組大鼠PVN內ACE、AT1R mRNA和蛋白含量的變化結果顯示，與Nomal組比較，Sham+VEH組PVN內ACE、AT1R mRNA和蛋白含量差異無統計學意義；與Sham+VEH組比較，CHF+VEH組ACE、AT1R mRNA和蛋白含量均明顯增加(P<0.01)；與CHF+VEH組相比，CHF+ Losartan組、CHF+QLQX-L組、CHF+QLQX-H組均可不同程度的降低PVN內ACE、AT1R mRNA和蛋白含量(P<0.01)(Fig 2)。

Tab2Changes of NE, NT-proBNP of

**P<0.01vsSham+VEH;#P<0.05,##P<0.01vsCHF+VEH

1:Normal;2:Sham+VEH;3:CHF+VEH;4:CHF+Losartan;5:CHF+QLQX-L;6:CHF+QLQX-H.**P<0.01vsSham+VEH;##P<0.01vsCHF+VEH group

2.5各組大鼠腎交感神經放電的結果比較結果顯示，與Nomal組比較，Sham+VEH組腎交感神經放電差異無統計學意義；與Sham+VEH組比較，CHF+VEH組腎交感神經放電強度明顯增加(P<0.01)；與CHF+VEH組相比，CHF+ Losartan組、CHF+QLQX-L組、CHF+QLQX-H組均可不同程度的降低腎交感神經放電(P<0.01)，但仍高于Sham+VEH組(Fig 3)。

1:Normal;2:Sham+VEH;3:CHF+VEH;4:CHF+Losartan;5:CHF+QLQX-L;6:CHF+QLQX-H.**P<0.01vsSham group+VEH;#P<0.05,##P<0.01vsCHF+VEH group

3討論

慢性心力衰竭是心臟泵血功能障礙與代償性激活的神經體液因子相互作用為特征的臨床綜合征，是高血壓、冠心病等許多心血管疾病的終末階段。交感神經系統異常激活是慢性心力衰竭的重要病理特征，其中樞激活機制成為近期研究的熱點。PVN是中樞內的整合區域，是直接調控交感神經傳出活動最主要的中樞位點。CHF時PVN神經元激活，腎交感神經活性增高。RAS系統是人體重要的調節系統，RAS的所有成分在腦內已經被發現，廣泛分布于中樞各個神經核團，其中以下丘腦、延髓等重要的心血管中樞含量最為豐富。近年來研究發現，中樞RAS系統的激活是促進交感神經活動，加重心衰進展的一個重要因素。腦內產生的Ang Ⅱ具有升高血壓[7]，降低壓力感受性反射的敏感性，促進交感神經激活等功能。給正常大鼠PVN區域注入Ang Ⅱ，使PVN神經元細胞激活，明顯增強交感神經傳出活動[8]。AT1R被證明是介導中樞Ang Ⅱ作用的最重要的受體，腦內Ang Ⅱ主要通過與AT1R的結合發揮作用[9]，當預先注射AT1R阻滯劑洛沙坦時AngII的作用被阻斷[2]。ACE是RAS代謝途徑的關鍵酶，ACE通過其水解產物Ang Ⅱ與AT1R結合來發揮其作用。長期側腦室給予ACE抑制劑賴諾普利可降低中樞部位細胞因子和氧化應激水平，降低交感神經活性[10]。

本研究發現，與假手術組大鼠相比，經冠狀動脈結扎術誘導的CHF大鼠PVN內RAS系統激活，Ang Ⅱ、ACE及AT1R的表達量上調，反映交感神經激活的指標血漿NE及腎交感神經放電增強，說明PVN局部RAS表達增多、功能上調與CHF時交感神經的過度激活有關。本研究還發現，CHF時大鼠心功能指標LVDd、LVDs、LVVd、LVVs、HW/BW、LW/BW、NT-proBNP升高，EF、FS降低，側腦室給予AT1R阻滯劑氯沙坦后降低交感神經激活的同時改善了大鼠的心功能，更加明確提示中樞RAS系統的活化是交感神經激活和心功能惡化的重要因素。

芪藶強心膠囊是近年在國內首先運用絡病理論指導CHF治療的中藥復方制劑，以益氣溫陽藥為治絡強心之本，輔以活血通絡藥，使氣旺血行絡通，兼利水消腫以治其標，具有多靶點、多環節、多途徑的治療特點。藥理和臨床研究表明，芪藶強心膠囊既能增強心肌收縮力，增加心排出量，具有傳統的強心、利尿、擴血管的作用[11],又能明顯抑制RAS系統的過度激活，抑制心室重構，延緩心衰的進展[12-13]。這些關于中藥芪藶強心膠囊對CHF治療研究焦點主要集中于外周。隨著心衰中樞機制研究的深入，我們也探索其治療的新途徑，前期的實驗采用微量注射泵經側腦室持續給藥，本實驗沿用此給藥方式，4周后檢測LVDd、LVDs、LVVd、LVVs、HW/BW、LW/BW的變化，各給藥組與模型組比較均改善了大鼠的心功能；心肌組織HE染色發現各治療組損傷程度減輕，從病理學角度進一步說明了側腦室給予芪藶強心膠囊可以改善心衰大鼠的預后；血漿NE及腎交感神經放電是交感神經激活的敏感指標，本研究顯示，與模型組比較，各給藥組均不同程度的降低了血漿NE及腎交感神經的活性，說明芪藶強心膠囊可通過作用于中樞部位抑制交感神經的激活來延緩心衰的進展。

前期的研究[3,14]發現通過側腦室長期慢性注射芪藶強心膠囊可以降低下丘腦內CRH神經元的激活，降低中樞炎性因子，降低交感神經系統，改善心衰大鼠心功能和心肌組織形態的改變，改善心室重構，初步顯示出芪藶強心可通過干預下丘腦CRH神經元的激活，降低炎性因子來降低交感神經的激活，延緩心衰的進展。本研究發現，與Sham+VEH組相比，CHF+VEH組大鼠下丘腦室旁核Ang Ⅱ、ACE、AT1R含量明顯增加，血漿NE及腎交感神經活性明顯增強，陽性藥物組和CHF+QLQX-L組、CHF+QLQX-H組均可使PVN部位Ang Ⅱ、ACE、AT1R含量減少，NE及交感神經放電活性降低，結果提示，藥物經側腦室注入大鼠后可能通過干預PVN部位RAS系統的激活來降低了交感神經的興奮性。

綜上所述，中樞RAS系統的激活與交感神經的活化在心衰的發生發展過程中起關鍵作用，本實驗中醇化芪藶強心膠囊抑制交感神經激活可能是調節PVN部位RAS系統的結果。但慢性心衰時中樞神經系統的激活機制以及中藥芪藶強心膠囊對心衰的中樞影響仍有待于進一步的研究。

(本實驗在河北以嶺醫藥研究院藥理室完成，得到王宏濤博士、張軍芳博士、賈振華導師及劉煥、單星閣老師的悉心指導，謹此致謝！)

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Effects of Qiliqiangxin on hypothalamic paraventricular nucleus renin angiotensin system and sympathetic nervous system in rats with heart failure

MA Liu-yi1,2,3,YIN Yu-jie1,2,3，ZHANG Jun-fang2,LIU Huan1,2,JIA Zhen-hua1，3

[1,GraduateSchoolofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China;2.DeptofCardiology,YilingMedicalInstituteofHebeiProvince,KeyLaboratoryofStateAdministrationChineseMedicine(Cardio-cerebralVascularCollateralDisease),Shijiazhuang050035,China;3.DeptofCardiology,YilingHospitalofHebeiMedicalUniversity(CollateralDiseaseTheoryKeyDisc-iplineofStateAdministrationofTraditionnalChineseMedicine),Shijiazhuang050091,China]

Key words:Qiliqiangxin; chronic heart failure; the hypothalamic paraventricular nucleus; renin angiotensin system; the sympathetic nerve; rat

Abstract:AimTo determine the effects of Qiliqiangxin injected into lateral ventricle on Cardiac function, angiotensin Ⅱ(Ang Ⅱ), angiotensin converting enzyme(ACE), angiotensin type 1 receptor(AT1R) and the sympathetic nervous system in the hypothalamic paraventricular nucleus of rats with chronic heart failure.MethodsRat model of heart failure was prepared by acute myocardial infarction that was induced by ligation of the left anterior descending coronary artery. Four weeks after heart failure, Qiliqiangxin and Losartan were continuously administered via a syringe pump injector connected to lateral ventricle. After four weeks, echocardiogram was used to evaluate the cardiac function and HE was used to observe myocardial tissue morphology, and enzyme linked immunosorbent assay was used to measure plasma norepinephrine(NE), serum NT-proBNP and Ang Ⅱ in the paraventricular nucleus.The expression of ACE and AT1R at mRNA and protein levels in the paraventricular nucleus was determined by Real-time PCR and Western blot, and the RSNA was measured by PowerLab in anesthetized rats.ResultsCompared with the sham control, the cardiac function was significantly lower while the AngII, ACE, AT1R expression in the paraventricular nucleus and RSNA were significantly increased in rats with heart failure. Compared with heart failure control, Qiliqiangxin and Losartan decreased the RSNA and the AngII, ACE, AT1R expression in the paraventricular nucleus.ConclusionGiving traditional Chinese medicine to the lateral ventricles can decrease the activation of the RAS system, reduce the renal sympathetic nerve activity and improve cardiac function.

收稿日期：2015-12-06，修稿日期：2016-02-06

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)資助項目(No 2012CB518606)；國家自然科學基金資助項目(No 81273978)

作者簡介：馬柳一(1987-)，女，碩士生，研究方向：慢性心力衰竭中樞機制，Tel:0311-66703020,E-mail:770908141@qq.com; 賈振華(1975-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：心血管病，通訊作者，E-mail:jiatcm@163.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.026

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0575-06

中國圖書分類號：R-332；R282.71；R331.31；R338.2；R541.610.22

網絡出版時間：2016-3-18 11:22網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.052.html