美金剛激活NGF/TrkA信號通路改善APP/PS1轉基因小鼠學習記憶障礙

姚維范，劉明妍，鐘　欣，楊時倫，杜　可，毛瑞琨，魏敏杰

(中國醫科大學藥學院藥理學教研室，遼寧 沈陽　110122)

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美金剛激活NGF/TrkA信號通路改善APP/PS1轉基因小鼠學習記憶障礙

姚維范，劉明妍，鐘欣，楊時倫，杜可，毛瑞琨，魏敏杰

(中國醫科大學藥學院藥理學教研室，遼寧 沈陽110122)

摘要:目的考察NGF/TrkA信號通路在美金剛(memantine，MEM)改善APP/PS1轉基因小鼠的學習記憶障礙中的作用及其相關機制。方法以Morris水迷宮、被動避暗試驗及自主活動試驗觀察動物行為學變化，免疫組化檢測小鼠腦內Aβ1-42表達水平，ELISA法及比色法考察其腦內ChAT及AChE活性，并用Western blot法檢測小鼠海馬NGF的水平及其特異性受體TrkA下游ERK通路相關蛋白的表達水平。結果MEM明顯改善APP/PS1轉基因小鼠的學習記憶障礙，并明顯降低其腦內Aβ1-42蛋白沉積。MEM可上調NGF表達水平，繼而激活NGF-TrkA通路，明顯增加TrkA、c-raf、ERK1/2及其下游效應蛋白CREB的磷酸化水平；同時，增強其腦內ACh生成酶ChAT并降低其水解酶AChE活性。結論MEM可能通過增加NGF的表達，激活TrkA信號通路，降低APP/PS1轉基因小鼠腦內Aβ1-42蛋白沉積，從而改善其學習記憶障礙。

關鍵詞：美金剛；NGF；TrkA；學習記憶障礙；阿爾茨海默病；Aβ

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是以認知障礙為其主要特征的進行性神經系統退行性疾病，其典型的病理改變為神經細胞間出現以β-淀粉樣肽(β-amyloid, Aβ)為核心的老年斑(senile plaques, SP)及神經元丟失等[1]。鹽酸美金剛(memantine hydrochloride,MEM)作為第一個美國FDA批準用于治療中、重度AD的藥物，是一種新型、低度親和力、電壓依賴、非競爭性NMDA(N-methyl-D-aspastate)受體拮抗劑，臨床研究顯示可明顯改善中、重度AD患者的認知、行為障礙[2-4]，其機制與通過非競爭性阻斷NMDA受體，降低谷氨酸引起的NMDA受體過度興奮，阻斷谷氨酸興奮性毒性，改善學習記憶能力有關[5-6]。然而，有研究表明，美金剛改善AD還與促進腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)表達，興奮M受體有關[7-8]，這提示著MEM可能存在多種神經保護機制的可能性。

神經生長因子(nerve growth factor, NGF)作為一種具有支持神經元發育、分化、維持及營養等生物學效應的神經營養因子家族中的一員，腦內NGF的缺乏將導致膽堿能神經元凋亡、死亡及功能降低，并可抑制Aβ沉積，降低Aβ的神經毒性[9-10]。然而，美金剛是否能通過調節NGF相關通路，調控膽堿能神經元功能，影響Aβ沉積，從而發揮其改善學習記憶障礙的神經保護作用，尚未見相關研究報道。因此，本研究擬對美金剛改善APP/PS1轉基因小鼠學習記憶障礙、降低Aβ沉積的神經保護作用進行考察，并進一步研究美金剛對APP/PS1轉基因小鼠NGF/TrkA信號轉導通路的影響及二者的相關性進行研究，旨在發現美金剛防治AD作用可能的新作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物C57 BL/6J 小鼠10只，♀♂各半，12月齡，(26±4)g；APP/PS1轉基因小鼠20只，♀♂各半，12月齡，體質量(23±3) g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。實驗過程中的動物飼養及取材均遵守實驗動物管理和保護的有關規定。

1.2藥物處理對照組(WT組)：12月齡C57 BL/6J小鼠10只，♀♂各半，每日等量于實驗組的雙蒸水灌胃，每日1次，連續灌胃4周；模型組(APP/PS1組)：12月齡APP/PS1轉基因小鼠10只，♀♂各半，每日等量于實驗組的雙蒸水灌胃，每日1次，連續灌胃4周；治療組(MEM-treated APP/PS1組)：12月齡APP/PS1轉基因小鼠10只，♀♂各半，每天按5 mg·kg-1體重灌胃400 mg·L-1的MEM水溶液(購自Sigma公司)，每日1次，連續灌胃4周。4周給藥結束后，即可開始行為學試驗，行為學試驗結束后，處死動物，取皮質及海馬，并進行組織固定。

1.3行為學試驗

1.3.1避暗試驗4周給藥結束后，開始被動避暗試驗，分為訓練和正式試驗兩個階段：訓練前將小鼠頭背著洞口放入明室(BA-200避暗自動測試儀，成都泰盟科技有限公司)，先適應環境3 min，然后給暗室銅柵通以36 V電流，小鼠一進入暗室即受電擊，其正確反應是回到明室，銅柵通電持續5 min，此為訓練過程。24 h后對小鼠進行記憶測驗，記錄小鼠第一次進入暗室的時間，此為避暗潛伏期，并記錄5 min內小鼠進入暗室的次數(即避暗穿梭錯誤次數)，5 min內未進入暗室的小鼠其潛伏期按300 s計算。

1.3.2Morris水迷宮試驗在被動避暗試驗結束后，開始Morris水迷宮試驗(Morris水迷宮裝置，北京碩林苑生物科技有限公司)，分為訓練期、定向航行試驗和空間搜索試驗3部分進行。訓練期：在定向航行試驗前1 d，水池中不放置平臺，使小鼠在水中自由游泳2 min，使其適應環境。定向航行試驗：進行定向航行試驗時，將平臺放在固定的第二象限。該試驗訓練小鼠每天4次，共5 d。訓練時，將小鼠面向池壁從4個入水點分別放入水池，記錄鼠入水到找到水下隱蔽平臺并站立于其上所需時間，作為潛伏期(latency)，用s表示，并記錄從小鼠入水至找到平臺通過路徑的總長度，用cm表示。小鼠找到平臺后，讓其在平臺上站立30 s。若入水后60 s若小鼠仍未能找到平臺，則將其輕輕從水中引導拖上平臺，并停留30 s，然后進行下一次訓練。每只鼠從4個入水點分別放入水池為1次訓練，兩次訓練之間間隔120 s。空間搜索試驗：在定向航行試驗結束后，即d 6，將平臺撤去，使其在水中尋找原平臺所在位置，共120 s，記錄從小鼠第1次到達平臺原來所在位置的時間(latency)，用s表示，以及小鼠穿越原平臺的次數，來評價小鼠記憶重現的能力。

1.3.3自主活動試驗將小鼠放入自主活動箱中(ZZ-6小鼠自主活動測試儀，成都泰盟科技有限公司)，記錄小鼠10 min內自主活動次數(locomotivity)和站立次數(stand-up)。

1.4免疫組化法檢測小鼠腦組織中APP和Aβ(1-40)蛋白表達行為學實驗結束24 h后，將各組小鼠3只以水合氯醛麻醉并先以200 mL生理鹽水心室內灌流，繼而更換以4%多聚甲醛溶液灌流，取腦固定24 h，常規石蠟包埋、切片，進行免疫組化染色。切片進行脫蠟，水化，3%的H2O2于37℃孵育20 min，微波修復，正常山羊血清封閉液37℃封閉30 min，一抗抗體Aβ1-42抗體(1 ∶1 000，購自CST公司)4℃孵育過夜，PBS洗后，SP法二抗37℃孵育1 h，DAB顯色，每張切片隨機數腦組織3個視野，用計算機圖像分析系統分別測定各組小鼠每張切片內表達陽性蛋白神經元的整合光密度值，以反映考察Aβ1-42陽性蛋白表達水平。

1.5Western blot檢測小鼠海馬組織中相關蛋白表達取各組3只小鼠海馬組織，放入預冷的RIPA Buffer裂解緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl buffer pH 8.0 containing 150 mmol·L-1NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate，0.1% sodium dodecyl sulphate，購自碧云天生物技術研究所)；0.1% phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF，購自Roche公司)中，冰上勻漿后，4℃ 12 000×g×30 min，取上清，BCA法蛋白定量(BCA試劑盒，購自碧云天生物技術研究所)。每孔蛋白上樣量50 μg，SDS-PAGE電泳分離蛋白并電轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉或5% BSA的PBST中室溫封閉2 h，一抗4℃過夜，兔抗NGF抗體(1 ∶400，購自Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗TrkA、phospho-TrkA抗體(1 ∶1 000，購自CST公司)；兔抗c-raf、phospho-c-raf、ERK1/2、phospho-ERK1/2(均為1 ∶1 500，購自CST公司)；兔抗CREB1、Phospho-CREB1抗體(1 ∶500，購自Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗Aβ1-42抗體(均為1 ∶1 000，購自CST公司)，兔抗或鼠抗β-actin(1 ∶2 000，1 ∶2 000, 購自Santa Cruz Biotechnology公司)中4℃過夜。PBST沖洗10 min×3遍，將膜放入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或鼠IgG(1 ∶2 000)中，室溫中搖床振蕩60 min，用PBST洗膜10 min×3遍，ECL顯影(Super ECL Plus超敏發光液購自北京普利萊基因技術公司)。

1.6小鼠海馬組織中ChAT和t-ChE活性測定取各組3只小鼠海馬組織，放入預冷的生理鹽水中，冰上超聲勻漿后，制成10%(W/V)的勻漿，2 000×g4℃離心10 min，取上清，BCA法蛋白定量(BCA試劑盒，購自碧云天生物技術研究所)后，根據試劑盒說明書檢測t-ChE及ChAT活性(t-ChE及ChAT檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所)。

2結果

2.1MEM可明顯改善APP/PS1小鼠的學習記憶能力為了研究MEM對APP/PS1小鼠學習記憶能力的影響，分別采用被動避暗試驗(PAT)、Morris水迷宮試驗(MWM)及自主活動試驗(LCT)來考察各組小鼠的與學習記憶相關的行為學改變。

首先，我們采用PAT法對各組小鼠經訓練后的避暗潛伏期(Fig 1A)和進入暗室錯誤次數(Fig 1B)進行了考察。結果顯示，MEM使APP/PS1小鼠的避暗潛伏期明顯延長(P<0.01)，進入暗室的次數明顯減少(P<0.01)，初步說明MEM可改善APP/PS1轉基因小鼠的學習記憶障礙。

**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsAPP/PS1 group

接著，通過Morris水迷宮試驗連續5 d考察定向航行試驗中尋找平臺潛伏期(Fig 2A)和尋找路徑長度(Fig 2B)的變化，結果顯示在定位巡航試驗的d 1，各組小鼠的尋找平臺潛伏期及路徑長度差異無統計學意義(P>0.05)；而在d 2～5定位巡航試驗的學習過程以后，MEM可使APP/PS1組小鼠的尋找平臺潛伏期和路徑長度明顯縮短(P<0.05)，并呈現出明顯的學習與記憶的獲得曲線。在d 6撤去平臺后的空間探索實驗中，繼續考察各組小鼠在原平臺所在目的象限的停留時間(Fig 3A)，以及原平臺所在位置的穿梭次數的差異(Fig 3B)對其記憶再現能力的影響，結果發現，MEM可明顯延長APP/PS1小鼠在目的象限的停留時間和穿梭次數(P<0.01)，這進一步說明MEM可改善APP/PS1小鼠的學習記憶障礙。

**P<0.01vsWT group;#P<0.05,##P<0.01vsAPP/PS1 group

最后，應用自主活動試驗考察各組小鼠的自主活動次數(Fig 4A)和站立次數(Fig 4B)的差異。結果顯示，各組小鼠的10 min內站立次數和自主活動次數差異均無顯著性(P>0.05)，提示APP/PS1小鼠的活動能力未受影響，即上述行為學指標的改變是由于學習記憶障礙所引起的，而不是由于小鼠活動能力的改變而引起的。

2.2MEM明顯降低APP/PS1轉基因小鼠海馬內Aβ1-42沉積前述的試驗結果已證實，MEM可改善APP/PS1小鼠的學習記憶障礙，而APP/PS1小鼠的學習記憶障礙又與Aβ沉積密切相關。因此，我們又采用免疫組化法對MEM是否能夠影響APP/PS1小鼠海馬和皮質中AD特異性病理標志物Aβ1-42沉積進行了考察。通過對Aβ1-42的研究發現(Fig 5)，APP/PS1組小鼠海馬及皮質Aβ1-42陽性細胞表達明顯增加，而MEM可明顯降低APP/PS1組小鼠皮質Aβ1-42陽性細胞表達(P<0.01)，提示MEM可改善APP/PS1小鼠皮質的Aβ1-42沉積。

**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsAPP/PS1 group

2.3MEM可提高APP/PS1轉基因小鼠海馬和皮質內ChAT和t-ChE的表達水平AD小鼠腦內膽堿能神經元功能降低，MEM作為抗AD經典藥物，是否對膽堿能神經元具有改善作用？這成為下一個我們關注的問題。我們對膽堿能神經元功能相關酶ACh生成的限速酶ChAT及水解酶t-ChE的表達水平進行了考察。研究發現，MEM可明顯增加APP/PS1組小鼠前葉皮質ChAT的活性(P<0.01，Fig 6A)，同時明顯降低其水解酶t-ChE的活性(P<0.05，Fig 6B)，提示MEM可通過提高ChAT，并降低t-ChE的活性，增加ACh的生成。

A:The typical immunohistochemical figures;B:The statistical results;**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsAPP/PS1 group

**P<0.01vsWT group;#P<0.05,##P<0.01vsAPP/PS1 group

2.4MEM調節APP/PS1轉基因小鼠海馬內NGF相關TrkA/p75NTR信號通路的平衡發揮其抗AD作用如前所述，MEM抑制神經細胞凋亡作用，從而發揮其神經保護作用，而也有研究表明MEM可增高腦內BDNF的表達水平[27]，提示MEM可能亦對神經元功能相關的神經營養因子有提高作用。而NGF作為一種神經營養因子，有大量研究已表明其對膽堿能細胞發揮營養支持及抑制細胞凋亡作用[19-20,28]。因此，我們以Western blot法考察了各組小鼠腦內NGF的表達水平，考察MEM提高膽堿能神經元的功能是否與神經生長因子NGF相關。結果顯示，MEM可明顯增加APP/PS1組小鼠海馬內NGF蛋白表達水平(P<0.01，Fig 7A)，表明MEM可上調APP/PS1小鼠海馬內低NGF狀態。進而，我們對NGF相關TrkA信號通路及其下游底物進行了考察，發現MEM可明顯增加APP/PS1小鼠海馬內TrkA(P<0.01，Fig 7B)、c-Raf(P<0.01，Fig 7C)、ERK1/2(P<0.01，Fig 7D)、CREB(P<0.01，Fig 7E)的磷酸化水平，但總蛋白水平不變，提示MEM通過激活NGF-TrkA信號通路，促進其下游ERK通路及與學習記憶相關底物CREB的激活，從而改善學習記憶能力。

3討論

鹽酸美金剛是一種治療中、重度AD的藥物，能夠明顯改善AD患者的學習記憶能力[11-12]。我們的研究結果也顯示，美金剛可改善12月齡APP/PS1轉基因AD小鼠的的學習記憶障礙(Fig 1～4)，并可降低其腦皮質內Aβ1-42表達水平(Fig 5～6)。這一結果與Alley等[13]、Nagkura等[14]與Arif等[15]研究發現的美金剛可降低AD細胞模型及APP/PS1轉基因小鼠腦內Aβ1-42的水平的研究結果顯示了一致性[16]。

美金剛可通過輕度非競爭性阻斷NMDA受體而發揮神經保護作用，但與其他臨床試驗失敗的非競爭性NMDA拮抗劑如Dizocilpine[(+)MK-801]、Cerestat(CNS-1102)、Licostinel(ACEA 1021)、Selfotel(CGS-19755)和d-CPP-ene相比[17]，美金剛除了阻斷NMDA受體外，美金剛還可通過降低AD動物腦內的Aβ沉積，保護海馬神經元不受Aβ細胞毒性作用[13,17-18]，同時，亦可抑制LTP，改善大鼠學習記憶障礙[19]，還可促進腦內BDNF表達，興奮M受體[7-8]，這提示MEM的抗AD作用存在多種可能保護機制。因此，本研究首次以美金剛調控腦內，NGF相關通路這一新的作用機制，對MEM改善12月齡(相當于中、重度AD)APP/PS1轉基因小鼠的學習記憶障礙及抑制腦內Aβ沉積的作用機制及其相關性進行了研究。

NGF作為一種主要的神經營養因子，對神經元主要起營養、支持作用，并可影響Aβ沉積，降低Aβ毒性，與學習記憶密切相關[16-17,20-22]。又有研究表明，NGF的合成主動依賴于NMDA受體的調控[23-24]，內源性NGF與膽堿能系統功能密切相關[22]。因此，我們考察了MEM對APP/PS1轉基因小鼠腦內NGF的影響，并同時對膽堿能神經元活性標記物ChAT及ACh水解酶t-ChE進行了考察，發現MEM可上調APP/PS1轉基因小鼠腦內NGF的表達水平，同時增加ChAT的活性，降低t-ChE的活性，提高了乙酰膽堿的表達(Fig 6～7A)。

已知NGF可通過激活其高親和力受體TrkA信號通路，調節細胞分化和生存，其下游底物CREB蛋白的磷酸化和激活，可阻斷Aβ的寡聚化和形成，降低Aβ的神經毒性[25]。以上提示，NGF/TrkA通路不僅與細胞生存密切相關，亦同時參與了抑制Aβ沉積過程，從而在AD過程中發揮著重要的作用。因此，我們發現MEM在上調NGF表達的基礎上，對NGF介導的高親和力受體TrkA信號通路與低親和力受體p75NTR信號通路進行了考察，以期探討MEM的抗AD作用是否與NGF及其信號通路活化相關。研究結果發現，MEM可使NGF高親和力功能性受體TrkA的磷酸化增加，并進一步激活其下游c-Raf和ERK1/2等蛋白的磷酸化，活化了促進細胞分化和生存的ERK信號傳導通路，但總蛋白水平不變(Fig 7)。這與Williams等[26]發現向出現記憶障礙的老年大鼠腦內注射NGF可增加基底前腦TrkA水平，并激活MAPK途徑，且ERK總蛋白水平不變的結果是一致的。同時，本研究亦發現MEM通過激活NGF/TrkA信號通路而增加其下游與學習記憶密切相關底物CREB的磷酸化(Fig 8D)，這與Autio等[27]發現的腹腔注射膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊和加蘭他敏可增加成年小鼠海馬內的TrkA磷酸化水平，進而增加CREB磷酸化水平的研究結果也是保持一致的。

Fig 7MEM treatment increased NGF expression(A),and activated NGF/TrkA signaling by increasing phosphorylation levels of TrkA(B),c-Raf(C) and ERK1/2(D), finally upregulated phosphorylation level of CREB(E) downstream in hippocampus of APP/PS1 mice by Western blot(n=3)**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsAPP/PS1 group

綜上結果，MEM可能通過增加NGF的表達，激活TrkA信號通路，降低APP/PS1轉基因小鼠腦內Aβ1-42蛋白沉積，從而改善其學習記憶障礙。

(致謝：本實驗在中國醫科大學藥理教研室完成，感謝魏敏杰教授和劉明妍教授的悉心指導，同時感謝鐘欣、楊時倫、杜可、毛瑞琨的參與和幫助。)

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signaling by increasing the phosphorylation of TrkA following the increased phosphorylation of c-Raf, ERK1/2 and downstream effector CREB after MEM treatment.ConclusionMEM treatment may activate the NGF/TrkA signaling in APP/PS1 mice to reduce amyloidosis and cognitive deficits.

Memantine improves cognitive deficits by activiating NGF/TrkA signaling in APP/PS1 transgenic mice

YAO Wei-fan, LIU Ming-yan, ZHONG Xin, YANG Shi-lun, DU Ke, MAO Rui-kun, WEI Min-jie

(DeptofPharmacology,SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China)

Key words:memantine；NGF；TrkA；cognitive deficits；Alzheimer′s disease；Aβ

Abstract:AimsTo study the role of NGF/Trk A signaling pathway in Memantine (MEM) improving APP/PS1 transgenic mice cognitive deficits and to explore its possible mechanisms. MethodsCognitive performance was assessed by Morris water maze(MWM), passive avoidance test(PAT) and locomotivity test. Aβ1-42protein levels were determined by immunohistochemistry. The activities of AChE and ChAT were also examined by ELISA and colorimetry. Western blot was used to detect the expression levels of NGF and its receptor TrkA and the downstream ERK pathway.ResultsMEM treatment significantly ameliorated the cognitive deficits, dramatically reduced the Aβ1-42overexpression. MEM increased the activity of choline acetyltransferase(ChAT), while decreased that of acetylcho-line esterase(AChE). Moreover, MEM activiated NGF

收稿日期：2015-12-09,修回日期：2016-01-11

基金項目：國家科技部“重大新藥創制”科技重大專項子課題(No 2013ZX09103001-003)，國家自然科學基金資助項目(No 81501098)，遼寧省教育廳科學研究一般項目(No L2012279)，遼寧省科學技術計劃項目(No 2013225079)

作者簡介：姚維范(1984-)，男，助理實驗師，研究方向：神經藥理學和分子腫瘤學，E-mail：ywf3209@163.com; 魏敏杰(1963-)，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：神經藥理學和分子腫瘤學，E-mail：weiminjiecmu@163.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.007

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0473-08

中國圖書分類號：R-332；R322.81；R338.64；R394；R745.7；R977.3；R977.6

網絡出版時間：2016-3-18 11:22網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.014.html

◇論著◇