SAHA在Leptin誘導的乳腺癌MCF-7細胞增殖過程中的調控作用

馮秀艷,韓　翰,周偉強

(1. 沈陽醫學院遼寧省環境污染與微生態重點實驗室,遼寧 沈陽　110034; 2. 沈陽醫學院附屬第二醫院內分泌科,遼寧 沈陽　110002)

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SAHA在Leptin誘導的乳腺癌MCF-7細胞增殖過程中的調控作用

馮秀艷1,2,韓翰1,周偉強1

(1. 沈陽醫學院遼寧省環境污染與微生態重點實驗室,遼寧 沈陽110034; 2. 沈陽醫學院附屬第二醫院內分泌科,遼寧 沈陽110002)

摘要:目的為了闡明SAHA調控Leptin誘導的乳腺癌ER+細胞系MCF-7細胞增殖的分子機制，我們采用實時無標記細胞分析系統，動態監測Leptin對MCF-7細胞生長狀況的影響。方法通過自動細胞分析儀Muse Cell Analyzer分析Leptin和SAHA對MCF-7細胞活力、細胞凋亡以及細胞周期產生的影響，并應用細胞凋亡抗體芯片測定Leptin和SAHA兩種處理因素作用MCF-7細胞后相關凋亡通路分子表達變化的情況。結果低濃度Leptin對MCF-7細胞生長有誘導作用，其濃度為0.625 nmol·L-1時作用效果最明顯。細胞分析結果表明，SAHA能明顯抑制Leptin誘導的MCF-7細胞增殖，經SAHA處理后MCF-7細胞活力明顯下降，細胞凋亡率明顯增多，細胞被大量阻滯于G0/G1期。凋亡抗體芯片篩查結果發現，SAHA可明顯誘導MCF-7細胞內促凋亡因子Bax、Caspase-3的表達，并且與凋亡產生密切相關的TRAIL DR5、p21CIP1蛋白的表達也明顯上升，Claspin、Clusterin、XIAP、Survivin蛋白的表達明顯下降，而Leptin對上述蛋白的表達具有相反作用。結論Leptin、SAHA對乳腺癌ER+細胞MCF-7的影響可能與乳腺癌細胞內凋亡通路激活有關，特別是與內源性線粒體凋亡通路引發的Caspase-3釋放密切相關。

關鍵詞：細胞凋亡；乳腺癌；雌激素受體陽性細胞；MCF-7；SAHA；瘦素

乳腺癌是威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，近年來發病率已居全球女性惡性腫瘤首位。據臨床統計，乳腺癌患者中0.7～0.8為雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性乳腺癌[1]，因此針對乳腺癌ER及其信號轉導通路的研究成為探究乳腺癌發生、發展原因的重要內容。瘦素(Leptin)是由167個氨基酸組成的16 ku蛋白質。它通過與相應受體OB-Rb結合而發揮其生物學效應。由于機體內Leptin水平和乳腺癌發生有著千絲萬縷的聯系，它可作為一種獨立危險因素參與乳腺癌的形成過程[2]。研究表明，人乳腺癌細胞系MCF-7有OB-Rb表達，并且Leptin可影響MCF-7細胞的生長，這可能與Leptin誘發乳腺上皮細胞分泌生長因子，加速乳腺癌細胞周期進程有關[3]。

隨著研究的不斷深入，人們發現乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化、糖基化等表觀遺傳性狀改變在乳腺癌發生、發展中具有重要的調控作用。其中乙酰化修飾主要是影響基因轉錄活性，對基因組DNA序列無改變[4]。在正常乳腺細胞中，組蛋白乙酰化轉移酶(histone acetyltransferase, HAT)將乙酰輔酶A上的疏水乙酰基部分轉移至染色質核心組蛋白氨基末端上特定賴氨酸殘基上，使DNA易于解聚、舒展，從而激活特定基因的轉錄。而組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)則通過移去組蛋白氨基末端賴氨酸殘基的乙酰基而抑制基因的轉錄。在乳腺細胞功能異常時，HDAC的活性明顯增強，組蛋白處于低乙酰化狀態，基因表達平衡狀態被破壞，使一些調控細胞增殖、分化、凋亡的基因表達失衡，導致乳腺癌的形成[5-6]。

SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)作為繼HMBA(hexamethy lenebisacetamide)之后的第2代羥肟酸類的組蛋白去乙酰化酶抑制劑，主要用于治療持續惡化或復發的T細胞淋巴瘤(CTCL)[7]。在本實驗中，我們將觀察SAHA對Leptin誘導的乳腺癌ER+細胞系MCF-7細胞增殖的影響，闡明SAHA調控Leptin誘導的乳腺癌MCF-7細胞增殖的分子機制。

1材料與方法

1.1材料人乳腺癌細胞株MCF-7購自美國ATCC細胞庫；RPMI 1640培養基，胎牛血清、青霉素以及鏈霉素購自美國Thermo公司；SAHA和人重組Leptin蛋白購自美國Sigma-Aldrich公司；Muse Cell Cycle kit、Muse Annexin & Dead Cell kit、Muse Count & Viability kit 試劑盒購自德國Merck Millipore公司；人固相凋亡抗體芯片試劑盒購自美國R&D公司；其它化學試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養將人乳腺癌MCF-7細胞用含0.1胎牛血清的RPMI 1640培養液(含100 mg·L-1青、鏈霉素)體積分數為0.05的CO2、37 ℃飽和濕度下培養。

1.2.2實時細胞增殖檢測將1×107·L-1乳腺癌MCF-7細胞接種于xCELLigence實時無標記動態細胞分析系統的E-Plate 96板(Roche)各孔中，待細胞進行無血清同步化處理后，各孔分別加入不同濃度的Leptin(0、0.625、1.25、2.5、6.25、12.5、62.5 nmol·L-1)進行孵育，以DMSO為對照組。通過xCELLigence系統中各孔微電阻量的變化動態監測0～60 h范圍內的細胞生長狀況。通過每孔中細胞指數(cell index, CI)的變化了解MCF-7細胞的生長情況，實驗重復3次。

1.2.3細胞活力檢測將5×108·L-1乳腺癌MCF-7細胞接種于6孔板各孔中，無血清培養液同步化處理后加入0.625 nmol·L-1Leptin和20 μmol·L-1SAHA與MCF-7細胞共同孵育32 h。細胞活力及細胞計數實驗參照試劑盒程序進行。將與Leptin和SAHA孵育后的細胞經胰酶消化，收集的2×105個細胞加入450 μL Count & Viability reagent靜置5 min后應用自動細胞分析儀Muse Cell Analyzer(Millipore)進行檢測。

1.2.4細胞凋亡檢測按“1.2.2”方法將Leptin和SAHA與MCF-7細胞共同培養32 h后，收集1×106個細胞，與100 μL Muse Annexin V & Dead Cell reagent室溫孵育20 min。應用自動細胞分析儀Muse Cell Analyzer檢測各處理因素誘導MCF-7細胞凋亡發生的情況。

1.2.5細胞周期檢測按“1.2.2”方法將Leptin和SAHA與MCF-7細胞共同培養32 h后，將收集的細胞300×g離心5 min后加入1 ml預冷的體積分數為0.7的乙醇-20 ℃過夜孵育。將乙醇固定后的MCF-7細胞加入200 μL Muse Cell Cycle reagent室溫避光靜置30 min后，通過自動細胞分析儀Muse Cell Analyzer測定細胞周期。

1.2.6固相凋亡抗體芯片檢測將大約1×107個經Leptin和SAHA處理后的MCF-7細胞按抗體芯片試劑盒程序進行裂解，14 000×g離心5 min后，應用BCA蛋白分析試劑盒測定Leptin和SAHA各處理組樣品的蛋白濃度。將200 μg蛋白樣品液加入已放有抗體包被PVDF膜的4孔板，各孔中4 ℃振蕩過夜。然后將蛋白樣品-抗體膜經PBS沖洗后分別加入1.5 mL生物素標記的二抗振蕩孵育1 h。PVDF膜經沖洗后加入HRP偶聯的鏈霉親和素孵育30 min。將等體積混合的ECL化學發光底物A、B 液均勻加在PVDF膜上，顯色5 min。化學發光成像系統曝光后，應用Gelpro Analyzer software(Media Cybernetics)計算膜上各抗體標記點的灰度值來決定Leptin和SAHA各處理組對MCF-7細胞凋亡蛋白表達的影響。

2結果

2.1Leptin誘導乳腺癌細胞增殖的實時監測為了解Leptin對乳腺癌ER+細胞MCF-7的誘導作用，我們應用xCELLigence RTCA分析系統實時觀測不同濃度Leptin對MCF-7細胞生長狀態的影響。從Fig 1中可以看出，低濃度Leptin對MCF-7細胞生長有刺激作用，0.625～6.25 nmol·L-1的Leptin都表現出較明顯的誘導細胞生長的效應，其中以0.625 nmol·L-1濃度的Leptin產生的誘導作用最明顯。但隨著Leptin作用時間的延長，標示細胞生長的CI曲線在孵育48 h后趨于一致，由此在本實驗中我們選定0.625 nmol·L-1濃度的Leptin為誘導MCF-7生長的最適濃度，32 h為Leptin作用MCF-7細胞的最適處理時長。另外我們還發現，高濃度Leptin(12.5或62.5 nmol·L-1)處理的MCF-7細胞，其CI曲線明顯下降，這說明高濃度Leptin對MCF-7細胞具有毒性作用，可明顯抑制MCF-7細胞的生長。

2.2Leptin、SAHA對乳腺癌細胞活力和細胞凋亡的影響為了更直觀探究Leptin和SAHA對乳腺癌ER+細胞MCF-7生長狀態的影響，我們分別應用0.625 nmol·L-1Leptin和先前實驗測定的針對MCF-7最適SAHA濃度(20 μmol·L-1)與MCF-7細胞孵育32 h后測定細胞活力和細胞凋亡。細胞活力檢測結果顯示：與DMSO對照組相比，經SAHA單獨處理后乳腺癌MCF-7細胞活力明顯下降，活細胞比率從0.86下降到0.76，而死細胞比率由0.14上升到0.24，與此對應的是Leptin處理后活細胞比率上升至0.95，表明Leptin誘導細胞生長的效果很明顯(Fig 2A)。細胞凋亡檢測結果顯示：與DMSO對照組相比，SAHA處理后的MCF-7細胞出現明顯的細胞凋亡，細胞的早、晚期凋亡誘導率分別達到0.04和0.45，而Leptin處理后的MCF-7細胞早、晚期凋亡誘導率則為0.01和0.04(Fig 2B)。

2.3Leptin和SAHA對乳腺癌細胞周期的影響我們觀察了Leptin和SAHA對MCF-7細胞周期產生的影響。結果發現， Leptin和SAHA對MCF-7細胞周期的影響程度有明顯的不同。經SAHA處理后，MCF-7細胞大多被阻抑于G0/G1期，G0/G1期細胞比率從DMSO對照組的0.69上升到0.81，S期細胞比率從0.21下降到0.10，而G2/M期比率無明顯變化；Leptin處理后MCF-7細胞G0/G1期、G2/M期細胞比率分別下降到0.58和0.03，而S期比率則上升到0.39(Fig 3)。這說明Leptin和SAHA對MCF-7細胞周期的影響主要集中在S期，對G2/M期進程的影響不明顯。

2.4Leptin和SAHA對乳腺癌細胞凋亡相關分子表達變化的影響為了明確Leptin和SAHA對乳腺癌MCF-7細胞凋亡影響的途徑，我們應用固相細胞凋亡抗體芯片，測定了Leptin和SAHA兩種處理因素對MCF-7細胞凋亡相關蛋白表達所產生的變化。結果表明，單獨SAHA處理可明顯誘導MCF-7細胞內促凋亡因子Bax、Caspase-3的表達，并抑制Claspin、Clusterin、XIAP、Survivin蛋白的表達，與對照組相比差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；而Leptin則作用相反，經0.625 nmol·L-1Leptin作用后，MCF-7細胞的Bax、Caspase-3的表達明顯下降，而Clusterin、Claspin、XIAP、Survivin的表達明顯上升，與對照組相比其差異具統計學意義(P<0.05或P<0.01)。另外我們還發現，與凋亡產生密切相關的TRAIL DR5、p21CIP1在SAHA的作用下也明顯升高(Fig 4，Tab1)。

*P<0.05,**P<0.01vsBasal

3討論

雌激素受體陽性乳腺癌作為最主要的乳腺癌類型，研究其特有的生物學特性，進而完善其內分泌治療手段和尋找抑制其轉移的新方法都具有重要的臨床價值。

近年來，發現瘦素作為重要的脂肪因子廣泛參與多種腫瘤如卵巢癌、乳腺癌、腎癌等的發生、發展過程。有研究指出瘦素可作為乳腺癌一種新的促生長因子誘導乳腺癌細胞增殖，且與乳腺癌分期、轉移密切相關，參與乳腺癌的發生發展全過程[8]。在本實驗中，我們應用外源性Leptin與人乳腺癌ER+細胞MCF-7共同孵育，發現低濃度Leptin(0.625～6.25 nmol·L-1)可明顯刺激MCF-7細胞生長，其中0.625 nmol·L-1Leptin誘導增殖的效果最明顯。相關細胞學實驗顯示，在0.625 nmol·L-1Leptin誘導下，MCF-7細胞活力增強，細胞凋亡發生率下降，進入S期細胞增多。這些數據都從不同角度證實了Leptin確實有誘導乳腺癌MCF-7細胞增殖的特性，并且Leptin可能通過自分泌或旁分泌方式擴大傳播增殖信號以促進乳腺癌細胞的轉移。

腫瘤的發生、發展是多因素作用的結果，其中離不開表觀遺傳學病因的作用。組蛋白乙酰化修飾是表觀遺傳學中的重要組成部分，當去乙酰化酶活性增強時組蛋白低乙酰化，阻礙基因轉錄的啟動子結合蛋白進入啟動子結合位點，從而抑制特定基因的轉錄。近年來，相關乳腺癌Ⅱ期臨床試驗發現，SAHA表現出良好的抑瘤療效[9]。在本實驗中，SAHA也顯示出明顯的抑制MCF-7增殖的特性。經20 μmol·L-1SAHA處理MCF-7細胞后，細胞活力明顯降低，早晚期細胞凋亡發生率明顯增多，細胞周期檢測結果顯示，SAHA處理后MCF-7細胞被大量阻滯于G0/G1期。

為了探究Leptin、SAHA對乳腺癌ER+細胞的影響，我們應用固相細胞凋亡蛋白芯片篩查了Leptin、SAHA作用MCF-7細胞后相關凋亡因子表達的變化。從結果中可以看出，在Leptin的作用下，MCF-7細胞內Bax、Caspase-3的表達明顯降低，XIAP、Survivin、Clusterin表達增加；而SAHA處理后的細胞Bax、Caspase-3的表達明顯上升，XIAP、Survivin、Clusterin表達下降。Bax是一種重要的凋亡促進因子，它可形成二聚體并抑制Bcl-2、Bcl-x的表達而促進凋亡的產生[10]。Caspase-3作為凋亡過程中最重要的關鍵反應元件，是細胞凋亡的主要執行者和效應分子，是多種凋亡激活信號傳遞的匯集點，它的活化是凋亡發生進入不可逆階段的標志[11]。而Survivin作為凋亡抑制因子，可直接抑制Caspase-3、Caspase-7的活性，從而抑制凋亡，有利于癌細胞的異常增殖和惡性轉化[12]。XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein)是凋亡抑制蛋白家族成員，可通過抑制凋亡信號轉導途徑中Caspase分子的活性而對細胞凋亡產生抑制作用[13]。Clusterin可通過與細胞質中Bax共同作用抑制細胞色素C的釋放而達到保護細胞的目的[14]。因此，從本實驗結果可以看出，Leptin、SAHA對乳腺癌ER+細胞MCF-7的影響可能與乳腺癌細胞內凋亡通路是否激活，特別是內源性線粒體凋亡通路引發的Caspase-3釋放密切相關。

在本實驗中，當用Leptin或SAHA處理MCF-7細胞后，TRAIL DR5受體表達發生明顯變化。TRAIL DR受體是TRAIL (TNF related apoptosis-inducing ligand)功能受體，負責傳遞細胞外凋亡信號，激活細胞內多種誘導細胞凋亡蛋白的表達。有研究證實，在乳腺癌組織中TRAIL的表達遠低于正常乳腺組織，而DR受體也呈現低表達，這提示乳腺癌的發生可能與TRAIL失活有關，也可能與TRAIL受體表達低引起的凋亡信號傳遞不足出現凋亡逃逸有關[15]。在本實驗中，Leptin抑制了MCF-7細胞表面TRAIL DR5受體的表達，而SAHA處理后TRAIL DR5受體表達明顯上升。因此，我們推測，在Leptin或SAHA作用乳腺癌MCF-7細胞過程中，TRAIL DR5受體介導的外源性死亡受體通路可能參與了相應的生物學作用。

綜上所述，在本實驗中，我們系統地研究了Leptin、SAHA對乳腺癌ER+細胞系MCF-7細胞活力和細胞凋亡變化的影響，通過形態學觀察、細胞周期測定了解Leptin、SAHA對MCF-7細胞增殖的作用，并應用凋亡抗體芯片探討了Leptin、SAHA作用MCF-7細胞后相關凋亡通路及分子表達變化的情況，我們的研究工作有助于深入理解SAHA調控Leptin誘導的乳腺癌MCF-7細胞增殖的分子機制，為不遠的將來研發新型抗乳腺癌藥物奠定一定的理論和實驗基礎。

(致謝：衷心感謝沈陽醫學院“遼寧省環境污染與微生態重點實驗室”為本實驗提供的實驗資源及實驗設備；感謝實驗室全體工作人員對本實驗的大力協助。)

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cell line MCF-7 induced by leptin. MethodsHuman breast cancer cell MCF-7 was incubated with SAHA and/or leptin, and cell viability, apoptosis and cell cycle of MCF-7 cells were detected by Muse Cell Analyzer. The expression of proteins related with apoptosis was determined by apotosis antibody array. ResultsReal-time cell proliferation assays indicated that the induction effect of leptin for MCF-7 cells reached the peak at a concentration of 0.625 nmol·L-1. SAHA reduced the viability of MCF-7 cells, induced G0/G1phase arrest in the cell cycle, and triggered the apoptosis. Meanwhile, SAHA significantly induced the protein expressions of some apoptotic factors, including Bax, Caspase-3, TRAIL DR5, p21CIP1, and inhibited the expressions of Claspin, Clusterin, x-linked inhibitor of apoptosis protein(XIAP) and survivin. However, leptin had reverse effects on the related expression of the proteins. ConclusionThe effects of cell proliferation by leptin and SAHA treatment in breast cancer ER positive cell line MCF-7 may involve in the activation of apoptosis pathway, in particular with releasing of Caspase-3 trigged by endogenous mitochondrial apoptosis pathway.

Regulation of SAHA on cell proliferation induced by leptin in breast cancer cell line MCF-7

FENG Xiu-yan1，2, HAN Han1,ZHOU Wei-qiang1

(1.KeyLaboratoryofEnvironmentalPollutionandMicroecologyofLiaoningProvince,ShenyangMedicalCollege,Shenyang110034,China;2.DeptofEndocrinology,the2ndHospitalofShenyangMedicalCollege,Shenyang110002，China)

Key words：cell apoptosis; breast cancer; estrogen receptor positive; MCF-7; SAHA; leptin

Abstract:To clarify the molecular mechanism of SAHA in the cell proliferation of ER-positive breast cancer

收稿日期:2015-12-24,修回日期:2016-02-08

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81172509)；遼寧省教育廳基金資助項目(No L2012370)

作者簡介:馮秀艷(1972-)，女，碩士，研究方向：抗癌藥物分析，E-mail：fengxy1972@hotmail.com； 周偉強(1970- )，男，博士，教授，研究方向：腫瘤調控，通訊作者,E-mail：zhouwq@hotmail.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.013

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0503-06

中國圖書分類號：R329.24；R329.25；R392.11；R737.9；R977.12

網絡出版時間：2016-3-18 11:22網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.026.html