瑞舒伐他汀減輕ApoE-/-小鼠動脈硬化形成與ST6Gal-Ⅰ表達相關性研究

劉　燕，張　軍，蒲強紅，鄧　瀟，于　超

(重慶醫科大學生命科學研究院,重慶　400016)

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瑞舒伐他汀減輕ApoE-/-小鼠動脈硬化形成與ST6Gal-Ⅰ表達相關性研究

劉燕，張軍，蒲強紅，鄧瀟，于超

(重慶醫科大學生命科學研究院,重慶400016)

摘要:目的探討瑞舒伐他汀抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成是否與唾液酸轉移酶(ST6Gal-Ⅰ)的表達相關。方法取ApoE-/-小鼠，分別采用高脂喂養16周(基線模型組，baseline)、高脂喂養23周(對照組，control)及高脂喂養23周且瑞舒伐他汀灌胃7周(藥物組，rosuvastatin)構建模型。分別測定3組ApoE-/-小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)的含量及主動脈斑塊面積，分析動脈粥樣形成的病理變化，確定高膽固醇血癥模型成立。通過免疫組織化學法分析主動脈內膜中ST6Gal-Ⅰ的表達。結果對照組與基線組相比，隨著高脂飼料喂養周數增加，小鼠血清中LDL-C、HDL-C、TC、TG均增加，其中LDL-C及TG變化差異具有顯著性(P<0.05)，其動脈弓斑塊面積明顯增大(P<0.05)，管腔內膜明顯增厚(P<0.05)，說明高膽固醇血癥模型構建成功。而瑞舒伐他汀處理藥物組與對照組比較，血脂四項指標、斑塊面積均有所下降，且LDL-C、TG水平及斑塊面積變化差異均有統計學意義(P<0.05)。分別檢測3組ST6Gal-Ⅰ表達顯示對照組較基線組動脈弓處表達上調，用藥后ST6Gal-Ⅰ表達明顯下調。結論瑞舒伐他汀預防小鼠動脈粥樣硬化形成的機制可能與ST6Gal-Ⅰ表達密切相關。

關鍵詞：動脈粥樣硬化；高膽固醇血癥；ApoE-/-小鼠；斑塊；瑞舒伐他汀；唾液酸轉移酶

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是嚴重危害人類健康的一種血管慢性炎癥性疾病[1-4]?；静∽冞^程是動脈內膜脂質沉積，內膜灶狀纖維化，粥樣斑塊形成，致血管壁變厚、管腔狹窄，并引起一系列繼發性病變，如引起冠心病、腦血管病和血栓性疾病等。到目前為止，AS的發病機制尚未完全清楚。普遍認為脂質代謝紊亂引起的炎癥反應與AS的發生發展有密切關系[3，5-6]。炎癥反應中，黏附分子如選擇素、選擇素配體、整合素等介導的單核-內皮細胞間的黏附在粥樣斑塊的發生發展中起了極其重要的作用[1]，是AS的早期特征和關鍵環節。這些環節的調控與多種因素有關，蛋白質翻譯后的調節是否參與其中還鮮為人知。我們團隊以往的研究顯示，蛋白質的糖基化對單核細胞-內皮之間相互作用的調控發揮著重要的作用[7-8]。蛋白糖基化是由細胞中催化特殊氨基酸殘基聯接聚糖基團的糖基轉移酶催化形成。其中β-半乳糖α2,6-唾液酸轉移酶1(ST6Gal-Ⅰ)是高爾基體上一個Ⅱ型跨膜蛋白, 可催化唾液酸以α-2,6糖苷鍵的形式連接到細胞膜表面功能蛋白的N-乙酰半乳糖胺上形成唾液酸化的糖蛋白，從而發揮生物學功能[9]。有研究表明，白細胞在PMA刺激分化成巨噬細胞過程中，ST6Gal-Ⅰ表達下調，膜上β1整合素的α2,6-唾液酸化明顯降低，從而增加了細胞的α4β1整合素與VCAM-1的黏附，說明炎癥刺激下ST6Gal-Ⅰ確實參與細胞黏附調控[10]。既然糖基轉移酶介導的糖基化修飾影響了細胞的生物學功能，那么本文中糖基轉移酶對AS過程中斑塊形成是否存在調控關系就成為我們關注的核心問題。這對揭示AS的發生、發展具有重要意義。

目前，瑞舒伐他汀是有效防治AS的藥物。他汀類藥物主要通過減少內源性膽固醇的合成，有效降低LDL-C、升高HLD-L，還可以通過上調內皮eNOS的表達發揮抗炎作用[11]。但是瑞舒伐他汀發揮抗AS機制的深度認識尚不全面。基于AS是在各種炎癥作用下發生的一系列病理改變，且炎癥與ST6Gal-Ⅰ的表達密切相關。探討藥物抗AS作用與ST6Gal-Ⅰ的表達關系，對于發現新靶點具有重要意義。已有文獻報道，AS病變與ST3Gal-Ⅳ密切相關[12]；在炎癥發生時血清中的α2,6-、α2,3-及α2,8-唾液酸化糖蛋白均發生差異表達[13]。而瑞舒伐他汀對AS的防治是否與唾液酸化糖蛋白表達有關尚未見報道。因此，本研究擬以ApoE-/-小鼠為實驗對象，高脂飼料喂養建立AS動物模型，分析瑞舒伐他汀藥物對AS斑塊的作用，并觀察給藥前后ST6Gal-Ⅰ在ApoE-/-小鼠血管AS形成區域的表達。以期判斷瑞舒伐他汀治療AS機制是否與功能蛋白糖基化有關。

1材料與方法

1.1動物和試劑健康♂載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE knocked-out mice ，ApoE-/-)，6周齡，體質量18～25 g,購置于重慶醫科大學實驗動物中心。瑞舒伐他汀(博騰精細化工股份有限公司，重慶)；油紅O(Sigma，USA)；蘇木精、伊紅、兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB染色試劑盒(中杉金橋，北京)；兔源多克隆ST6Gal-Ⅰ抗體(Sigma，USA)；熒光正置顯微鏡(Olympus，日本)；血糖試紙(羅氏，德國)；高脂高膽固醇飼料(含20%脂肪，0.125%膽固醇)由北京科澳協力飼料有限公司制備。

1.2動物模型的構建及分組36只ApoE-/-小鼠于SPF級分籠喂養，應用隨機表原則，將其分為3組，每組12只：① 基線模型組(baseline)：髙脂高膽固醇飼料喂養16周處死；② 空白對照組(control)：髙脂高膽固醇飼料喂養23周處死；③ 瑞舒伐他汀組(rosuvastatin)：高脂高膽固醇飼料喂養23周，并在后7周同時對小鼠給予瑞舒伐他汀灌胃處理，瑞舒伐他汀以PBS緩沖液配置，給藥劑量2.4 mg·kg-1·d-1[14]。處死前1 d晚上禁食不禁水。

1.3血樣的采集及生化指標的測定ApoE-/-小鼠經戊巴比妥麻醉后行眼眶采血，分離血清，測定血糖、血脂四項，即低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)的水平，于重慶醫科大學附屬大學城醫院檢驗科測得。

1.4標本的采集及主動脈標本的制備ApoE-/-小鼠麻醉采血后處死，剖開胸腹腔用生理鹽水沖洗干凈，分離心、肝、脾、肺、腎、小腸及心臟等重要臟器，取出心臟和主動脈，從主動脈根部開始取材，剪下1～1.5 cm連接心臟的血管放入4%的多聚甲醛中固定，經洗滌、脫水、透明，進行常規石蠟包埋，從主動脈根部0.2 cm起間斷均勻切面，切片厚度為5 μm，用防脫玻片黏附切片。

1.5油紅O染色取主動脈弓(1～2 mm)的心臟，剔除動脈弓處多余脂肪，充分暴露主動脈，橫切左右心房，是切面垂直主動脈根部，用吸水紙將組織塊的固定液充分吸干，OCT包埋劑滴到樣品托盤上，是主動脈垂直朝上將心房組織完全植入到包埋劑中。調整組織使主動脈垂直向上，將樣品連同托盤放到速凍臺上迅速冰凍30 min。冰凍切片機切片，溫度-20℃左右，切片厚度8 μm，使用防脫玻片不同位置貼片，并在普通顯微鏡10倍視野下，觀察到主動脈瓣結構出現時，更換防脫玻片貼片，正式保留切片進行染色。冷凍切片干燥后入60%異丙醇浸洗10min ，油紅O工作液染色10 min ，60%異丙醇分化3～10 s至間質清晰，水洗，Mayer蘇木精復染1 min，自來水返藍， 用濾紙小心吸干水分，甘油明膠封片，Olympus倒置顯微鏡采集圖像。

1.6蘇木精-伊紅染色( hematoxylin-eosin, HE)取主動脈根部石蠟切片于60℃烤箱中30 min，迅速放入二甲苯中及100%、95%、80%、70%濃度梯度無水乙醇脫蠟處理后，迅速放入雙蒸水中5 min，沖洗3次,蘇木素染色15 min，沖洗后0.5%的鹽酸乙醇3 s，沖洗后0.5%伊紅染色2 min，依次70%、80%、95%、100%乙醇中脫水，二甲苯中固定后中性樹膠封片。

1.7免疫組化取主動脈根部石蠟切片于60℃烤箱中30 min，迅速放入二甲苯中及100%、95%、80%、70%濃度梯度無水乙醇脫蠟處理后，迅速放入雙蒸水中5 min，沖洗3次，將玻片放入檸檬酸鹽緩沖液中，微波爐中高火3 min，低火微沸10 min，進行抗原修復，自然冷卻至室溫，PBS沖洗。用3%的H2O2去離子水孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗，加入ST6Gal-Ⅰ一抗(1 ∶40稀釋)，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，滴加polymer helper室溫孵育20 min，PBS沖洗，滴加poly-HRP anti-Rabbit IgG室溫孵育20 min，PBS沖洗，DAB染色，蘇木精復染，于70%、80%、95%、100%乙醇中脫水，二甲苯固定，中性樹膠封片。

2結果

在實驗過程中小鼠均無異常死亡，基線模型組(baseline)、空白對照組(control)和瑞舒伐他汀組(rosuvastatin)造模前后的體重及血糖變化差異均無顯著性，且3組小鼠的攝食量及重要臟器(心、肝、脾、肺、腎)的質量差異均無統計學意義。

2.1瑞舒伐他汀對小鼠各種血脂水平的影響血脂檢測結果顯示，基線模型組小鼠血清中LDL-C、HDL-C、TC、TG均高于正常值，表明模型構建成功。23周高脂飼料飼養的對照組小鼠血清中LDL-C、TG和TC水平均高于基線模型組(Fig 1A～D)。但藥物組小鼠血清中上述三指標均有所降低，表明瑞舒伐他汀的確具有降脂活性。

2.2瑞舒伐他汀降低主動脈弓斑塊面積經高脂喂養23周的對照組與16周的基線模型組比較，小鼠主動脈管弓的動脈斑塊面積明顯增加(P<0.05)。而藥物組與對照組比較，斑塊面積明顯減少(P<0.05)，見Fig 2。說明瑞舒伐他汀具有預防斑塊形成的作用。

2.3瑞舒伐他汀明顯降低小鼠主動脈內膜的厚度分析血管內膜的變化情況，結果如Fig 3所示，可見基線模型組小鼠血管主要病理改變為：內膜明顯增厚，內皮排列紊亂且不連續，管壁厚度增加，平滑肌遷移內膜，中膜平滑肌明顯萎縮變薄。表明模型構建成功。增加高脂喂養時間的對照組與基線模型組比較，病變呈明顯的進行性加重趨勢。動脈內膜連續性更弱，內膜厚度進一步增加，差異有顯著性(P<0.05)。瑞舒伐他汀藥物組與對照組相比，內膜厚度明顯降低(P<0.05)。結果與上述油紅O染色斑塊面積變化趨勢一致。

2.4瑞舒伐他汀上調主動脈弓內膜中糖基轉移酶ST6Gal-Ⅰ為分析瑞舒伐他汀藥理作用是否與唾液酸轉移酶表達存在關聯。分別取3組小鼠主動脈弓，制備石蠟切片，通過免疫組化分析唾液酸轉移酶表達分布情況。結果顯示，ST6Gal-Ⅰ在各組均有表達，3組血管內皮細胞層均可見棕色顆?；蜃厣【€。表明ST6Gal-Ⅰ主要分布于內膜下內皮細胞層。表明ST6Gal-Ⅰ主要分布于內膜、中膜平滑肌層。如Fig 4所示，對照組與基線模型組比較，血管內皮層ST6Gal-Ⅰ的表達量隨著高脂飼料的長期喂養而明顯降低。而瑞舒伐他汀藥物組與對照組相比，隨著AS的病理性變化減弱，血管內皮中ST6Gal-Ⅰ蛋白表達量有所增加。提示在AS發生、發展的進程中，α2,6-唾液酸轉移酶的表達與之密切相關，且瑞舒伐他汀可以有效回復唾液酸轉移酶的表達。瑞舒伐他汀可能通過影響糖基轉移酶的表達來發揮治療AS的作用。α2,6-唾液酸轉移酶可能是個全新的藥物作用靶點。

3討論

動脈粥樣硬化是心血管疾病中最常見的疾病，也是危害人類健康的常見病，已成為全球關注的熱點。其形成基礎是脂質代謝異常導致血管內皮細胞的損傷和功能紊亂，血管中膜平滑肌細胞表型發生轉換、由內膜向中膜遷移、增殖并形成纖維帽以包裹泡沫細胞等粥樣物質[15]，誘發慢性炎癥反應[3]，從而形成動脈粥樣斑塊。瑞舒伐他汀因有較好的降脂及抗炎作用，可逆轉粥樣斑塊形成，因此常用于抗動脈粥樣硬化研究。近年來大量研究證實，瑞舒伐他汀除了調血脂作用外，還可通過調節內皮功能、抗血栓形成、穩定斑塊、抑制血管炎癥等多種途徑治療和預防AS 的發生發展。

唾液酸是9碳單糖，通常以短鏈殘基的形式鏈接在糖蛋白、糖脂等糖綴合物的末端，如以α-2,3糖苷鍵連接到半乳糖(Gal)上,α-2,6糖苷鍵連接到半乳糖或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)上,α-2,8糖苷鍵連接到其他唾液酸上。唾液酸是重要的生物信息傳遞分子,細胞表面糖蛋白和糖脂的唾液酸化修飾在許多生物過程中發揮著至關重要的作用,包括細胞黏附、抗原識別和信號傳導等。唾液酸糖基轉移酶可以把胞苷一磷酸-β-N-乙酰神經氨酸(CMP-β-N-acetylneuramic acid)中的唾液酸基轉移到糖蛋白和糖脂的鏈端，根據轉移唾液酸基后新形成的糖苷鍵的類型可以把唾液酸糖基轉移酶分為四類，其中ST6Gal-Ⅰ催化α-2,6糖苷鍵連接類型的糖蛋白形成，具有調節細胞之間的相互作用的潛力。如在結腸直腸癌轉移灶中ST6Gal-Ⅰ的活性升高明顯，而在正常結腸黏膜細胞中ST6Gal-Ⅰ的活性很低或不存在[16-18]。表明與腫瘤細胞轉移關系密切。

本研究采用高脂飼養ApoE-/-小鼠構建AS模型，通過血液指標和組織形態分析，顯示瑞舒伐他汀干預7周后，小鼠血脂水平與對照組比較，LDL-C、TG均明顯下降(P<0.05)；油紅O染色結果顯示，瑞舒伐他汀干預組主動脈弓部斑塊面積較對照組明顯減?。籋E染色亦顯示瑞舒伐他汀組內膜厚度較對照組明顯變薄，3組結果均說明瑞舒伐他汀具有降脂及抑制斑塊形成的作用。免疫組化技術分析表明，對照組主動脈弓部管腔內皮層中ST6Gal-Ⅰ的表達明顯降低。給予瑞舒伐他汀處理后， ST6Gal-Ⅰ的表達上調，說明動脈粥樣硬化斑塊的發展與唾液酸轉移酶有密切關聯。以往研究顯示，AS是在各種炎癥作用下發生的一系列病理改變，而炎癥與糖基轉移酶的變化密切相關。Doring等[12]發現在敲除ST3Gal-Ⅳ的小鼠中動脈粥樣硬化的發生率明顯較低。Gracheva等[19-20]研究顯示動脈粥樣硬化病人動脈內膜下和血清中唾液酸糖基轉移酶活性均明顯增加?；谏鲜鲅芯?，我們認為糖基轉移酶與動脈粥樣硬化病理過程存在的密切聯系是值得關注的， ST6Gal-Ⅰ表達變化可能是瑞舒伐他汀抑制動脈粥樣硬化斑塊形成的機制之一。因此，進一步揭示唾液酸轉移酶與治療動脈粥樣硬化的分子機制，可以為臨床治療動脈粥樣硬化提供新的靶點，但是更深層的作用機制還需進一步的研究。

(致謝：本實驗在重慶醫科大學生命科學研究院轉化醫學實驗室完成，感謝重慶醫科大學提供的科研平臺，感謝實驗主要參與人員張軍老師、蒲強紅師兄、鄧瀟師兄的幫助，感謝導師于超教授對該實驗及論文撰寫的悉心指導。)

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12) and rosuvastatin group(n=12). Sixteen weeks later, control group was sacrificed. Serum and aortic intima were saved. Control group and rosuvastatin group were fed for seven weeks continually.Concentrations of serum lipids(TC, TG, LDL and HDL) were analyzed. Sections from the aortic root were examined by Hematoxylin-Eosin(HE) staining. The size of atherosclerotic lesion in each section was evaluated. Expression of ST6Gal-Ⅰ in aortic intima was detected by immunohistochemistry.ResultsPlasma TG and LDL-C, plaque areas and intimal thickness of control group were significant higher than those of baseline group(P<0.05).Those results indicated that the AS model was successfully constructed. After seven weeks,the plaque areas and concentrations of serum lipids of rosuvastatin group were obviously smaller than those of control group(P<0.05). The expression of ST6Gal-Ⅰ in aortic root was decreased in control group compared to the baseline, and which was increased in control group compared to the rosuvastatin group.ConclusionRosuvastatin could inhibit the progression of atherosclerosis, which might be related to the expression of ST6Gal-Ⅰ in aortic root.

Correlation of ST6Gal-Ⅰ expression and atherosclerotic plaque reduction induced by rosuvastatin in ApoE-/-mice

LIU Yan,ZHANG Jun,PU Qiang-hong,DENG Xiao,YU Chao

(InstituteofLifeSciences,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Key words:atherosclerosis; hypercholestrolemia; ApoE-/-mice; plaque; rosuvastatin; ST6Gal-Ⅰ

Abstract:AimTo investigate whether rosuvastatin induced reduction of atherosclerotic plaque was related to the expression of Sialyltransferase(ST6Gal-Ⅰ)in ApoE-/-mice.MethodsSix-weeks old ApoE-/-mice fed with high fat were divided randomly into three groups: baseline group (n=12), control group (n=

收稿日期:2015-12-16,修回日期:2016-02-05

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No NSFC 81370403); 高等學校博士學科點專項科研基金資助課題(No 201255 03110008)

作者簡介:劉燕(1991-)，女，碩士生，研究方向：心血管病炎癥機制，E-mail:liuyan_yanliu@163.com； 于超(1963-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：心血管病炎癥機制，通訊作者，E-mail:yuchaom@163.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.017

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0525-06

中國圖書分類號：R-332；R322.12；R543.502.3；R589.22；R972.6

網絡出版時間：2016-3-18 11:22網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.034.html