淫羊藿苷抗自發性高血壓大鼠腎小管上皮細胞凋亡的作用

朱　玲，王穎婉，李葉麗，錢志強，楊　華，楊丹莉

(1.遵義醫學院藥理學教研室暨基礎藥理省部共建教育部重點實驗室；2.遵義醫學院附屬醫院病理科，貴州 遵義　563000)

?

淫羊藿苷抗自發性高血壓大鼠腎小管上皮細胞凋亡的作用

朱玲1，王穎婉1，李葉麗1，錢志強1，楊華2，楊丹莉1

(1.遵義醫學院藥理學教研室暨基礎藥理省部共建教育部重點實驗室；2.遵義醫學院附屬醫院病理科，貴州 遵義563000)

摘要：目的觀察淫羊藿苷(icariin，Ica)對自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)腎小管上皮細胞凋亡的影響，探討其可能的機制。方法將21只14周齡♂ SHR隨機分為模型組，Ica低、高劑量組(20、40 mg·kg-1，ig，bid，至26周齡)，14周齡♂ 同源京都大鼠(WKY)為對照組，各組動物數均為7只。WKY組、模型組同期灌胃等體積雙蒸水。采用HE染色觀察腎臟病理學變化；原位缺口末端標記法檢測腎小管上皮細胞凋亡；real time RT-PCR法檢測腎Bok、Bcl-2、Bax mRNA水平；Western blot法檢測腎Bcl-2、Bax、Active caspase-3蛋白表達。結果與WKY組相比，模型組腎小球囊腔狹窄且不規則，腎小球系膜基質增多，細胞排列紊亂，毛細血管擴張充血，個別腎小球出現皺縮，腎小管上皮細胞水腫、管腔狹窄；腎小管上皮細胞凋亡明顯，Bok 和Bax mRNA水平、Bax和Active caspase-3蛋白表達均明顯上調，Bcl-2 mRNA和蛋白的水平明顯下調(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，Ica-L組、Ica-H組腎小球囊腔增寬，腎小球系膜基質增生減少，細胞排列紊亂有所改善，毛細血管擴張充血、腎小管管腔狹窄均減輕；腎小管上皮細胞凋亡以及 Bok、Bax mRNA水平和Bax蛋白表達均明顯下調，Ica-H組腎Bcl-2 mRNA水平和蛋白表達明顯上調，Active caspase-3蛋白表達明顯下調(P<0.05或P<0.01)。結論淫羊藿苷可抑制SHR腎小管上皮細胞凋亡，其機制可能與下調Bax、Active caspase-3、Bok，上調Bcl-2表達有關。

關鍵詞：淫羊藿苷；自發性高血壓大鼠；凋亡；Bcl-2；Bax；Active caspase-3

高血壓是心腦血管疾病發病與死亡的危險因素。腎臟既是引起高血壓的重要器官，也是高血壓損害的靶器官。高血壓性腎損害指原發性高血壓所導致的腎臟小動脈或腎實質的損害，是一個長時持續的過程，為高血壓病的主要并發癥。原發性高血壓腎損害發病機制復雜，主要原因為血管活性物質平衡失調和腎小動脈硬化導致的腎血流動力學異常[1]。有研究報道，原發性高血壓是引起高血壓腎損傷并導致終末期腎衰竭的重要病因之一[2]，在高血壓的進程中引起的腎臟損傷與腎小管上皮細胞凋亡、氧化應激、能量代謝有關[3-4]。Ica是淫羊藿的主要活性成分之一。現代藥理學研究表明，Ica具有改善心腦血管功能、增強免疫功能、抗心肌細胞凋亡、抗SHR腎纖維化等作用[5-7]。故本研究擬用SHR的腎為研究對象，觀察Ica對SHR腎小管上皮細胞凋亡的影響。

本研究使用14周齡♂ SHR，給予Ica灌胃至26周齡，采用HE染色觀察腎臟病理學變化，觀察Ica是否具有改善高血壓腎損害的作用。采用TUNEL法觀察Ica對SHR腎小管上皮細胞凋亡的影響。在確證其具有抗SHR腎小管上皮細胞作用的基礎上，采用real time RT-PCR法和Western blot法檢測腎Bcl-2、Bax、Bok、Active caspase-3的mRNA或蛋白變化，研究其抗凋亡的作用機制，旨在為Ica用于SHR腎損害的治療提供基礎藥理學依據。

1材料與方法

1.1藥品、試劑與儀器淫羊藿苷(純度≥98%)購自南京澤朗醫藥有限公司；RNA逆轉錄試劑盒、熒光混合物、β-actin、Bcl-2、Bax、Bok引物購自TaKaRa生物工程公司；RNA擴增儀，美國Eppendorf公司；Bcl-2、Bax、Active caspase-3兔抗鼠抗體購自美國Abcam公司；HRP標記的β-actin抗體購自上海康成生物技術有限公司；ECL發光劑，七海生物有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG，江蘇碧云天生物技術研究所；原位細胞凋亡檢測試劑盒(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)，德國ROCHE公司；Mini-PROTEAN3電泳儀、real time RT-PCR擴增儀、Mini Trans-Blot轉移系統、CCD成像系統，美國 BIO-RAD公司；Olympus光學顯微鏡及照相系統，日本Olympus公司。

1.2實驗動物及標本制備14周齡的♂ SHR大鼠21只、WKY 大鼠7只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。SHR大鼠隨機均分為3組，分別為模型組(n=7)、Ica低劑量組(20 mg·kg-1,n=7)和Ica高劑量組(40 mg·kg-1,n=7)，WKY大鼠作為對照組(n=7)。所有大鼠適應性飼養1周后，Ica低劑量組與Ica高劑量組分別給予Ica 20、40 mg·kg-1，ig，bid至26周齡，模型組和對照組給予等體積雙蒸水，實驗結束后處死動物，取標本備用。

1.3腎臟病理學給藥至26周齡后，7%水合氯醛(0.35 g·kg-1)經腹腔注射麻醉成功后，取各組大鼠腎臟組織，置于4%甲醛溶液中固定48 h后，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察腎臟病理學的形態變化。

1.4腎小管上皮細胞凋亡檢測TUNEL法測定腎小管上皮細胞凋亡，光學顯微鏡下觀察每組腎小管上皮細胞凋亡情況，正常細胞核顯藍色，凋亡陽性細胞核呈棕黃色，計算每400倍放大視野凋亡細胞數目與細胞總數的百分比。

1.5Real-time RT-PCR法檢測大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax、Bok mRNA的表達取各組腎組織，置于1ml TRIzol中提取總RNA并純化，經兩步法-聚合酶鏈反應分別檢測β-actin、Bcl-2、Bax、Bok mRNA的表達。所檢測基因的引物序列參照GenBank中大鼠β-actin、Bcl-2、Bax、Bok序列設計，見Tab1。目的基因表達用相對定量法：以PCR擴增過程中熒光信號強度達到閡值所需要的循環數(cycle threshold，Ct值)為統計參數，依次計算下列數據，Ct值的平均值=(Ctl+Ct2)/2(重復管)；dCt=Ct值的平均值-中間值(相同檢測基因的不同樣品Ct值的平均值中居中的值)；基因的表達=2-dct；相對定量=目的基因的表達/內參基因的表達×100，將WKY組的mRNA表達設為100。

1.6Western blot法檢測腎臟組織中Bcl-2、Bax、Active caspase-3的表達取各組大鼠腎臟組織約0.1 g，剪碎后放入1 mL RIPA裂解液中，加入PMSF 10 μL，冰上勻漿后靜置30 min，4℃離心12 000 r·min-1，20 min，取上清液，BCA法測定待測樣品的總蛋白濃度。每孔上樣量為30 μg蛋白配置為10 μL上樣體系，SDS-聚丙烯酰胺凝膠，上層5%濃縮膠，下層12%分離膠。電泳后采用Bio-Rad Mini Trans-Blot轉移系統PVDF膜轉膜，5%蛋白封閉液封閉2.5 h，TBST洗膜10 min×3次，一抗結合：β-actin(1 ∶5 000)、Bcl-2(1 ∶200)、Bax(1 ∶1 000)、Active caspase-3(1 ∶2 000)4℃ 過夜；TBST洗膜10 min×3次，兔二抗(1 ∶2 000)，常溫浸泡1.5 h，ECL化學發光顯色，Bio-Rad CCD成像系統獲取圖像。

1.7統計學分析實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行One-way ANOVA處理，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett，T3法,P<0.05認為有統計學意義。

2結果

2.1腎臟病理學HE染色顯示WKY組腎小球毛細血管管腔開放良好，系膜基質及細胞無明顯增生，腎小球囊無滲出。與WKY組比較，模型組腎小球囊腔狹窄且不規則，腎小球系膜基質增多，細胞排列紊亂，毛細血管擴張充血，個別腎小球出現皺縮，腎小管上皮細胞水腫，管腔狹窄；與模型組比較，Ica-L組腎小球囊腔略增寬，腎小球系膜基質減少，部分毛細血管擴張充血，細胞排列紊亂有所改善，腎小管管腔狹窄不明顯；Ica-H組腎小球囊腔明顯增寬，腎小球系膜基質無明顯增生，細胞排列良好，毛細血管管腔開放良好，腎小管結構正常，見Fig 1。

2.2腎小管上皮細胞凋亡檢測與WKY組比較，模型組腎小管上皮細胞凋亡明顯(P<0.01)，腎臟內凋亡陽性細胞主要見于腎小管上皮細胞和腎小球血管內皮細胞；與模型組比較，Ica-L組低、Ica-H組腎小管上皮細胞凋亡減少(P<0.01)，見Tab2，Fig 1。

2.3腎臟組織Bok、Bcl-2、Bax mRNA的表達與WKY組比較，模型組Bok、Bax mRNA的水平均明顯上調(P<0.01)，Bcl-2 mRNA的水平明顯下調(P<0.01)；與模型組比較，Ica-L、Ica-H組Bok、Bax mRNA的水平均明顯下調(P<0.01)，Ica-H組Bcl-2 mRNA的水平明顯上調(P<0.01)，Ica-L組Bcl-2 mRNA的水平差異無統計學意義(P>0.05)，見Fig 2。

2.4腎臟組織中Bcl-2、Bax、Active caspase-3蛋白的表達與WKY比較，模型組Bax、Active caspase-3蛋白的表達均明顯上調(P<0.05或P<0.01)，Bcl-2蛋白的表達明顯下調(P<0.01)；與模型組比較，Ica-L、Ica-H組Bax蛋白的表達均明顯下調(P<0.01)，Ica-H組Active caspase-3蛋白的表達明顯下調(P<0.05)，Ica-L組Active caspase-3蛋白的表達差異無統計學意義(P>0.05)，Ica-H組Bcl-2蛋白的表達明顯上調(P<0.01)，Ica-L組Bcl-2蛋白的表達差異無統計學意義(P>0.05)，見Fig 3。

A:WKY; B:Model; C:Ica-L; D:Ica-H，the scale is 50 um, and solid arrows indicate renal cysts, otherwise hollow arrows indicate mesangial matrix ; TUNEL solid arrow indicates the apoptotic cells

Tab2Apoptotic percentage of renal tubular epithelial

##P<0.01vsWKY；**P<0.01vsmodel

##P<0.01vsWKY；**P<0.01vsmodel

#P<0.05，##P<0.01vsWKY；*P<0.05，**P<0.01vsmodel

3討論

SHR的發病機制和病理與人類高血壓病相似，是目前研究原發性高血壓應用最廣泛的動物模型。本研究結果顯示，與WKY組比較，SHR出現明顯的高血壓腎損害的病理改變，說明26周齡的SHR已出現腎損害。該結果與本實驗室既往研究揭示的26周齡SHR出現腎損害的報道一致[7]。本研究中，Ica明顯改善26周齡SHR的腎損害。有研究報道，Ica可減輕大鼠腎臟缺血/再灌注損傷[8]。

目前研究已證實，細胞凋亡參與了高血壓靶器官損害，并在調節靶器官細胞數量，保護器官功能方面發揮著非常重要作用[9]。細胞凋亡是細胞在生理或病理狀態下發生的一種自發性、程序性死亡的過程。已有研究報道，促進腎小管上皮細胞的凋亡可加重SHR、腎缺血/再灌注損傷等腎損害[8,10]。本研究TUNEL染色結果顯示，模型組腎臟發生細胞凋亡且凋亡細胞主要為腎小管上皮細胞，而Ica-L、Ica-H組腎臟細胞凋亡減少，特別是腎小管上皮細胞凋亡明顯減少，提示Ica具有抗腎小管上皮細胞凋亡的作用。

線粒體通路在細胞存亡機制中起著至關重要的作用，尤其Bcl-2蛋白家族和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)家族目前最受關注。Bcl-2家族成員按其功能可分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩種，Bcl-2是主要的抗凋亡蛋白，Bax、Bok是促凋亡蛋白，而Bax是促凋亡代表成員。已有研究表明，Bax和Bcl-2都是以線粒體為靶細胞器發揮作用[11-12]。Bax蛋白多以非活性單體形式分布于胞質中，只有在接收到凋亡信號刺激被激活后，發生分子構象改變，移位并插入線粒體外膜后形成Bax 大孔道，破壞線粒體膜的完整性，并與Bcl-2 等抑制凋亡的蛋白對抗，阻止其抗凋亡作用的發揮[13]。caspase-3是ICE(白細胞介素1-β轉化酶) 家族成員之一，又稱為半胱氨酸蛋白酶32(CPP32)，與Ced-3同源性最高，是多種凋亡途徑的共同下游效應部分，在細胞凋亡過程中占據核心地位，被稱為“死亡執行蛋白酶”[14]。Bcl-2、Bax蛋白位于線粒體上游，是線粒體膜的通透性改變的重要調控因素[15]，其過度表達能控制cyt-C的釋放和下游 caspase-3蛋白酶的活化，介導細胞的存活或死亡[16]。

淫羊藿系小檗科淫羊藿屬植物，具有補腎陽，強筋骨，祛風濕的功效。有研究報道，Ica具有抗生殖細胞凋亡的作用[17]，Ica還可通過抑制caspase-3激活減輕SHR心肌細胞凋亡[6]，在5/6腎切除大鼠模型中，Ica通過調節Bax和Bcl-2的表達，改善腎臟功能[18]。本研究結果顯示，與WKY組比較，模型組Bok、Bax mRNA的水平以及Bax、Active caspase-3蛋白的表達明顯上調，Bcl-2 mRNA的水平以及Bcl-2蛋白的表達下調，提示腎組織Bcl-2、Bax、Active caspase-3、Bok表達的變化可能參與SHR腎損害的發生發展。Ica-L、Ica-H組Bok、Bax mRNA和Bax蛋白，Ica-H組Active caspase-3蛋白的表達均低于模型組，而Ica-H組Bcl-2 mRNA和蛋白的表達均高于模型組，提示Ica可能通過抑制腎組織的Bax、Bok、Active caspase-3的表達，上調Bcl-2的表達從而發揮抗SHR腎小管上皮細胞凋亡的作用。

綜上，Ica對SHR腎損害的保護作用至少與其抑制其腎小管上皮細胞凋亡有關，其機制可能是抑制Bax、Bok、Active caspase-3的表達，促進Bcl-2的表達。本研究為中藥淫羊藿的主要活性成分Ica用于腎損害的治療提供基礎藥理學依據。

(致謝：本實驗所有工作均在遵義醫學院藥理學教研室暨基礎藥理省部共建教育部重點實驗室完成，感謝教研室的支持和幫助，感謝王俊逸、華亮、吳芹、高楊等提供的無私幫助！)

參考文獻：

[1]高秀林.高血壓腎損害發病機制的研究進展[J].北京醫學，2007，29(9)：559-61.

[1]Gao X L. Advances in the pathogenesis of hypertensive renal damage[J].BeijingMedicalJournal, 2007,29(9):559-61.

[2]Gassanov N，Pollok M，Er F.Acute renal failure associated with malignant hypertension[J].DtschMedWochenschr,2009,134(44)：2224-7.

[3]蔣嘉燁，羅珊珊，栗源，等.SHR高血壓進程中腎臟蛋白表達譜的變化[J].中國藥理學通報，2012，28(2):189-94.

[3]Jiang J Y, Luo S S, Li Y,et al. Study in the renal protein expressions during the developing progress of SHR[J].ChinPharmacolBull, 2012,28(2):189-94.

[4]周巧玲，唐榮，朱莉莉，等.冬蟲夏草對自發性高血壓大鼠腎臟Klotho表達和腎小管上皮細胞凋亡的影響[J].中華腎臟病雜志，2009,25(4)：305-12.

[4]Zhou Q L, Tang R, Zhu L L, et al. Effects of cordyceps sinensis on Klotho expression in kidneys and apotosis in renal tubular epithelial cells of spontaneously hypertensive rats[J].ChinJNephrol, 2009,25(4):305-12.

[5]龔其海，楊丹莉，石京山，等.淫羊藿苷的神經藥理作用及分子機制研究進展[J].中國新藥與臨床雜志，2011，30(7):481-6.

[5]Gong Q H, Yang D L, Shi J S, et al. Advances in neuroharmacological effects and molecular mechanisms of icariin[J].ChinJNewDrugsClinRem, 2011,30(7):481-6.

[6]錢志強，王穎婉，李葉麗，等.淫羊藿苷通過抑制caspase-3激活減輕自發性高血壓大鼠心肌細胞凋亡[J].遵義醫學院學報，2015,38(5)：450-3.

[6]Qian Z J，Wang Y W， Li Y L，et al. Icarrin attenuates myocardial apoptosis by inhibiting activation of caspase-3 in spontaneously hypertensive rats[J].JZunyiMedUniv, 2015,38(5)：450-3.

[7]李葉麗，王穎婉，李意奇，等.淫羊藿苷通過降低醛固酮水平減輕自發性高血壓大鼠腎間質纖維化[J].中國藥理學通報，2014，30(4)：519-22.

[7]Li Y L，Wang Y W, Li Y Q, et al. Icariin attenuates renal interstitial fibrosis by reducing aldosterone in SHR[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(4):519-22.

[8]豐貴文，劉龍山，尚文俊.淫羊藿苷對大鼠腎臟缺血再灌注后炎性損傷的保護[J].中國組織工程研究，2012，16(40):7496-502.

[8]Feng G W, Liu L S, Shang W J. Icariin alleviates renal ischemia-reperfusion injury in rats through inhibition of inflammation[J].ChinJTissueEnginRes, 2012,16(40):7496-502.

[9]Hamet P, Richard L, Dam T V, et al. Apoptosis in target organs of hypertension[J].Hypertension, 1995,26:642-8.

[10]Balasubramanian S, Jansen M, Valerius M T, et al. Orphan nuclear receptor Nur77 promotes acute kidney injury and renal epithelial apoptosis[J].JAmSocNephrol, 2012, 23(4)：674-86.

[11]Gupta S, Da S B, Sen S. Cardiac hypertrophy: mechanisms and therapeutic Opportunities[J].AntioxidRedoxSignal, 2007, 9(6):623-52.

[12]Renault T T, Teijido O, Missire F, et al. Bcl-xL stimulates Bax relocation to mitochondria and primes cells to ABT-737[J].IntJBiochemCellBiol, 2015, 64:136-46.

[13]Tan K O, Fu N Y, Sukumaran S K, et al. MAP-1 is a mitochondrial effector Of Bax[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2005,102( 41) :14623-8.

[14]Odonkor C A, Achilefu S. Modulation of effector caspase cleavage determinesresponse of breast and lung tumor cell lines to chemotherapy[J].CancerInvest, 2009,27( 4) :417-29.

[15]Lin H H, Chen J H, Huang C C, et al. Apoptotic effect of 3,4-dihydroxybenzoic acid on human gastric carcinoma cells involving JNK/p38MAPK signaling activation[J].IntCancer, 2007,120( 11) :2306-16.

[16]Scorrano L, Korsmeyer S J. Mechanisms of cytochrome c release by proapoptotic Bcl-2 family members[J].BiochemBiophysResCommun, 2003,304( 3) :437-44.

[17]章振保，田生平，楊鏡秋，等.淫羊藿苷與辜酮治療亞急性衰老雄性大鼠的實驗研究[J].中國男科學雜志，2006，20(8):13.

[17]Zhang Z B, Tian S P, Yang J Q,et al. The experimental study on the treatment of sub一acutely aging male rats by Icariin and testosterone[J].ChinJAndrol, 2006,20(8):13.

[18]朱鐵錘.淫羊藿苷對5/6腎切除大鼠Bcl- 2、Bax 表達的影響[J].中國老年學雜志，2013(33)：4206-7.

[18]Zhu T C. Icariin on 5/6 nephrectomized rats Bcl- 2, Bax expression[J].ChinJGerontol, 2013(33)：4206-7.

Anti-apoptotic effect of Icariin on renal tubular epithelial cell in SHR

ZHU Ling1, WANG Ying-wan1, LI Ye-li1, QIAN Zhi-qiang1, YANG Hua2，YANG Dan-li1

(1.DeptofPharmacologyandKeyLaboratoryforBasicPharmacologyofMinistryofEducation,ZunyiMedicalCollege,ZunyiGuizhou563000,China;2.AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,ZunyiGuizhou563000，China)

Key words:Icariin; spontaneously hypertensive rats; apoptosis, Bcl-2；Bax；Active caspase-3

Abstract:AimsTo observe the effect of Icariin(Ica) on apoptosis of renal tubular epithelial cell in spontaneously hypertensive rats(SHR), and to explore its possible mechanism.Methods21 male SHR of 14 weeks were randomly divided into model groups, the Ica low and high dose groups (20 or 40 mg·kg-1，ig, bid, to 26 weeks), 14 week-old male homologous Kyoto rats(WKY) as control group, and the number of each group was 7. WKY group and model group were administered by gavage with the same volume of double distilled water. The pathological changes were observed by using the HE staining and the apoptosis was detected by TUNEL method in renal tubular epithelial cell, respectively. The mRNA levels of Bok, Bax, Bcl-2 were detected by the real time RT-PCR and the protein expressions of Bcl-2, Bax and Active caspase-3 were detected by Western blot method in the renal tissue.ResultsCompared with WKY, renal capsule was narrow and irregular, and glomerular mesangial matrix was increased with the cell arrangement disorder and the capillary dilation and congestion. Several glomeruli shrank and renal tubular epithelial cell was edema with luminal stenosis in model group. The apoptosis of renal tubular epithelial cell was evident and the mRNA levels of Bok and Bax, as well as the protein expressions of Bax and Active caspase-3 were significantly up-regulated in model group, while the mRNA Level and protein expression of Bcl-2 significantly down-regulated(P<0.05 orP<0.01).Compared with model group, renal glomerular capsule widened, proliferation of glomerular mesangial matrix was reduced, and cell arrangement disorder and capillary dilation and renal tubular lumen stenosis were improved in Ica group. Renal tubular epithelial cell apoptosis was decreased evidently, and the mRNA level of Bax, Bok and protein expression of Bax were significantly down-regulated in Ica group, and the mRNA level and protein expression of Bcl-2 in Ica-H group were significantly up-regulated while the protein expression of Active caspase-3 significantly down-regulated(P<0.05 orP<0.01).ConclusionIca can inhibit the apoptosis of renal tubular epithelial cell in spontaneously hypertensive rats and its mechanism may be related to the down-regulation of Bok, Bax, and Active caspase-3, accompanied with the up-regulation of Bcl-2.

收稿日期:2016-01-11,修回日期:2016-02-27

基金項目：國家自然科學專項基金(No 81241142)

作者簡介：朱玲(1990-)，女，碩士，研究方向：心血管藥理學、抗炎免疫藥理學，E-mail：lingluhappy@foxmail.com； 楊丹莉(1971-)，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：心血管藥理學、抗炎免疫藥理學， 通訊作者，Tel: 0851-28609616, E-mail：zmuyangdanli@foxmail.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.019

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0537-05

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R322.61；R329.25；R544.1

網絡出版時間：2016-3-18 11:22網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.038.html