含噻唑烷-4-酮的免疫調節劑對RA患者iNKT細胞免疫調節功能的影響①

孟　明　張雪嬌　甕沛杉　許鳴華　陳　丹　侯明輝　陳冬志

(河北大學醫學部，保定071000)

·臨床免疫學·

含噻唑烷-4-酮的免疫調節劑對RA患者iNKT細胞免疫調節功能的影響①

孟明張雪嬌甕沛杉許鳴華②陳丹侯明輝陳冬志③

(河北大學醫學部，保定071000)

[摘要]目的：研究新型合成的含噻唑烷-4-酮的免疫調節劑(CH1b)對活動期RA患者iNKT細胞免疫調節功能的影響。方法：從RA患者外周血中分離得到單個核淋巴細胞(PBMC)，α-Galcer和IL-2體外刺激擴增后，經磁珠分選(MACS)得到純化的iNKT細胞，分成對照組(IL-2)、α-Galcer組(IL-2+α-Galcer)、CH1b組(IL-2+CH1b)。采用MTT法測定各組RA患者iNKT細胞增殖率；MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine kit檢測各組RA患者iNKT細胞培養上清中IFN-γ和IL-4的水平；采用RT-PCR方法檢測各組RA患者iNKT細胞中IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA的表達水平。結果：與對照組和α-Galcer組相比，CH1b組iNKT細胞增殖率明顯增加(P<0.05)；與對照組相比，α-Galcer組IFN-γ和IL-4分泌水平明顯增加(P<0.05)，CH1b組IFN-γ和IL-4的分泌量也明顯增加，IFN-γ/IL-4 明顯降低(P<0.05)；與對照組相比，α-Galcer組IFN-γ mRNA與IL-4 mRNA表達均明顯增高，CH1b組IFN-γ mRNA表達差異不明顯，IL-4 mRNA的表達明顯增高。結論：新型合成的免疫調節劑(CH1b)可促進活動期RA患者活化的iNKT細胞增殖，并促進IL-4的分泌，上調IL-4 mRNA的表達，誘導iNKT細胞向Th2方向分化，對恢復RA病人體內免疫平衡具有重要意義。

[關鍵詞]類風濕關節炎；iNKT細胞；免疫調節劑；IFN-γ/IL-4

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA) 是以全身關節部位的慢性炎癥和骨質破壞為主要病理特征的自身免疫性疾病，RA發病機制復雜，多種免疫細胞參與了RA的發病過程。目前認為：Th1/Th2細胞功能失衡導致的過度炎癥可能是RA發病的中心環節。RA患病率達1%，致殘率超過腦血管疾病，目前尚缺乏特效的RA藥物和治療手段[1]。

近年發現，恒定自然殺傷T細胞(invariant nature killer T,iNKT)在自身免疫性疾病中有重要作用，并且與RA發病密切相關。iNKT細胞具有雙向調節的特點,既可以通過分泌多種細胞因子影響T細胞、NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)的功能，又能夠直接殺傷腫瘤等靶細胞[2]。iNKT細胞通過調節Th1亞群與Th2亞群之間的平衡，來維持機體內環境的穩態。目前多項研究結果表明，RA的發病可能與iNKT細胞數量和分泌細胞因子功能異常有關[3-5]。免疫調節劑是一類能非特異性地增強或抑制機體免疫功能的新型藥物，通過與免疫系統各種淋巴細胞間的相互作用或免疫分子內在的網絡活化作用,調整機體免疫功能、糾正免疫紊亂,現已廣泛應用于臨床治療[6]。本課題組前期設計、合成了一系列含噻唑烷酮的糖類衍生小分子免疫調節劑。前期實驗結果顯示:這類結構新穎的免疫調節劑具有促進T細胞增殖、NK 細胞殺傷活性,還能夠提升巨噬細胞功能等方面的免疫調節活性[7，8]。

本課題在前期研究的基礎上進一步探討含噻唑烷酮的糖類衍生小分子免疫調節劑CH1b對活動期RA患者iNKT細胞的影響，以便了解此類免疫調節劑是否能夠促進RA患者iNKT細胞功能，從而為開拓此類免疫調節劑潛在性的RA治療作用提供依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象選擇50例類風濕關節炎病例(均為2012年11月至2014年7月期間于河北大學附屬醫院風濕免疫科就診的病人),男20例，女30例，年齡在16~63歲，平均為(50.94±2.14)歲，所有 RA 病例均符合2010年美國風濕病協會(ACR)/歐洲抗風濕聯盟(EULAR)修訂的分類標準[9]。依據疾病活動性評分28(Disease activity score 28，DAS28) 來評估疾病活動性，評分為2.6~5的歸為活動期RA[10]。上述研究得到河北大學附屬醫院倫理委員會批準同意。

1.1.2試劑與儀器細胞培養液 RPMI1640、胎牛 血清(FBS)、PBS 為 Invitrogen 公司產品；PCR儀購自Bio-Rad Company(Hercules,California,USA)公司。Ficoll-PaqueTMPlus、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)購自Sigma公司。MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine kit購自Merk Millipore(Massachusetts,USA)。Anti-iNKT MicroBeads(Human)、Anti-iNKT-PE(抗人TCRVα24鏈抗體)和Human IL-2購自Mihenyi Biotec (Mihenyi Biotec，GmbH)公司。CD3-FITC及同型IgG1抗體購自BD Pharmingen(CA，USA)。α-Galcer購自ENZO Life Sciences公司。PCR擴增試劑盒購自Tansgene Company (Strasbourg,France)。引物由華大科技公司合成。

1.2方法

1.2.1外周血單個核細胞制備采集活動期RA病人外周靜脈血5~10 ml,用EDTA抗凝,3 000 r/min離心5 min，吸取上層血清。向剩余血細胞中1∶1加入PBS吹打混勻，用滴管緩慢將其疊加于Ficoll-Paque分離液液面上。室溫下2 000 r/min,離心20 min。離心后用滴管小心吸取上、中層間的單核細胞(PBMC)云霧狀細胞層移入一新離心管中,加入5倍以上體積的PBS洗滌，1 000 r/min，10 min，棄上清。洗滌細胞兩次，100 ml/L胎牛血清的AIM-V培養基調整細胞密度為2×106ml-1，備用。

1.2.2iNKT細胞體外擴增將上述制備的PBMC接種于250 ml培養瓶。加入終濃度為100 ng/ml的α-Galcer和終濃度為100 U/ml的IL-2置于37℃，5%CO2的孵箱中進行培養。每4 d更換一次培養液，并調整細胞濃度為2×106ml-1，加入新鮮AIM-V完全培養基和上述終濃度的α-Galcer和IL-2繼續培養。

1.2.3iNKT細胞純化及純度檢測收獲各組培養16~21 d的PBMC進行iNKT細胞的純化及純度檢測。分離過程嚴格按照抗人iNKT微珠提供的操作說明書操作。主要步驟如下:收集擴增后的PBMC，離心洗滌，使細胞在預冷的PBS中重懸，重懸比為每108個細胞與400 μl PBS構成單位反應體系;每單位反應體系加入100 μl抗iNKT細胞磁珠進行標記,混勻后置于4℃環境中標記15 min。之后每單位反應體系加入1 ml緩沖溶液洗滌,1 000 r/min離心10 min,棄上清,在500 μl預冷的PBS中重懸。然后采用LS柱進行磁珠分選。純化得到的iNKT細胞，取一部分用FITC標記的抗人CD3抗體和PE標記的抗人iNKT抗體進行流式檢測，iNKT細胞純度可達90%以上[11]。

經過體外擴增后，iNKT細胞占PBMC的比例由(0.12±0.07)%增長到(0.97±0.13)%；經過磁珠法分離純化后，每次實驗能夠得到約4×106個iNKT細胞且純度可達90%以上。

1.2.4iNKT細胞增殖實驗將分離得到的人iNKT細胞以2×106個/ml接種于96孔板，每孔90 μl。實驗設對照組(IL-2)、α-Galcer組(IL-2+α-Galcer)、CH1b組(IL-2+CH1b)。對照組加入10 μl IL-2(100 U/ml)，α-Galcer組加入10 μl IL-2(100 U/ml)及10 μl α-Galcer (100 U/ml)，CH1b組加入10 μl IL-2(100 U/ml)及10 μl最佳有效濃度的CH1b(5 μmol/L)。每組設3個復孔，置于37℃，5%CO2條件培養68 h后，每孔加入10 μl 5 mg/ml的MTT溶液，繼續培養4 h，離心棄上清，每孔加入100 μl DMSO，振蕩均勻后570 nm處測定吸光度(A)值，根據公式計算增殖率：增殖率(%)=(A給藥組-A對照組)/A對照組×100%。

1.2.5iNKT細胞培養上清中IFN-γ和IL-4含量檢測將分離得到的iNKT細胞按照上述增殖實驗條件處理，每組設3個復孔，置于37℃，5%CO2條件培養72 h后，離心，收集上清，采用MILLIPLEX檢測各組IFN-γ和IL-4水平。

1.2.6RNA抽提及cDNA第一鏈合成分別向收獲的iNKT細胞中加入1 ml Trizol反復多次吹打,室溫靜置5 min。裂解液中加入200 μl氯仿劇烈振蕩15 s,室溫靜置5 min，4℃13 000 r/min，離心15 min。小心吸取上清水相移至另一離心管,加入等體積的異丙醇,顛倒混勻，室溫靜置10 min,4℃13 000 r/min離心10 min，去上清。加入1 ml 75%乙醇，8 000 r/min，4℃離心5 min，小心吸盡上清，干燥沉淀5 min,加入10 μl的DEPC水溶解RNA 沉淀。用紫外分光光度計測定RNA 的純度與含量，所得RNA 的A260/A280在1.8～2.0之間，RNA的濃度為(1 400±103.5)ng/μl。將RNA樣本進行逆轉錄，嚴格按照M- MLV First Strand Kit提供的操作流程進行：向PCR管中分別加入總RNA 3 μg、Olig odT 1 μl、10 mol/L dNTP 2 μl、補足DEPC水至12 μl，混合物65℃加熱5 min后，迅速置于冰上冷卻。短暫離心后，加入：5×buffer 4 μl、0.1 mmol/L DTT 2 μl、核酸酶抑制劑1 μl，將各種成分混勻，37℃孵育5 min。室溫加入M-MLV逆轉錄酶1 μl并吹打混勻，37℃孵育50 min,70℃加熱15 min以終止反應。

1.2.7PCR反應內參β-actin上游引物:5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物:5′-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3′；人IFN-γ上游引物：5′-TGTAGCGGATAATGGAAC-3′，下游引物：5′-ATGTATTGCTTTGCGTTG-3′；人IL-4上游引物：CCCTCTGTTCTTCCTGCTA-3′，下游引物：5′-TCTGGTTGGCTT-CCTTCA-3′。PCR反應體系如下：10×PCR buffer 5 μl、上游引物1.5 μl、下游引物1.5 μl、dNTPs 2 μl、Taq酶 0.5 μl、ddH2O水 37.5 μl、cDNA模板2 μl，總體積 50 μl。擴增條件為95℃ 5 min；95℃ 30s，55℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，35個循環；72℃ 7 min終止反應。反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳(100 V,70 min) 檢測。

2結果

2.1活動期RA患者iNKT細胞頻率及流式分選結果實驗結果發現，活動期RA患者iNKT細胞頻率為(0.12±0.07)%，體外擴增后，iNKT細胞頻率增長到(0.97±0.13)%；采用磁珠法分離純化后，iNKT細胞純度達90%以上(圖1)。

2.2CH1b對 RA病人iNKT細胞增殖的影響實驗結果發現，培養后對照組的iNKT細胞增殖率為(28.33±3.17)%。與對照組相比，CH1b組細胞的增殖率增加了(7.23±1.14)%，差異顯著(P<0.05)；與α-Galcer組相比CH1b組細胞增殖率增加了(6.17±1.03)%,差異顯著(P<0.05)(圖2)。

2.3CH1b對RA病人iNKT細胞培養上清中IFN-γ和IL-4的影響與對照組相比，α-Galcer組IFN-γ和IL-4水平分別增加了(60.14±7.36)%、(44.42±5.13)%，差異顯著(P<0.05)；CH1b組IFN-γ和IL-4的分泌量分別增加了(19.73±3.25)%、(144.4±9.77)%，差異顯著(P<0.05)。對照組IFN-γ/IL-4為2.8±1.3，α-Galcer組為3.2±1.7，CH1b組為1.27±0.56,組間比較，差異顯著(P<0.05)(圖3)。

2.4CH1b對RA病人iNKT細胞IFN-γ和IL-4 mRNA表達的影響與對照組相比，α-Galcer組IFN-γ mRNA表達與IL-4 mRNA表達均明顯增高；CH1b組IFN-γ mRNA表達差異不明顯，IL-4 mRNA的表達明顯增高(圖4)。

3討論

iNKT細胞是一類識別由CD1d提呈的糖脂類抗原的固有型免疫細胞,活化后迅速釋放大量細胞因子調控免疫細胞分化，直接或間接參與機體免疫應答，在抗感染、抗腫瘤及自身免疫反應中發揮重要調節作用。近年研究結果表明，iNKT參與RA發病，并在疾病發展過程中發揮重要調節作用[12，13]。

我們前期研究結果顯示：與健康人相比，活動期RA患者外周血中iNKT細胞頻率明顯降低，病情緩解后iNKT細胞頻率可恢復至接近正常水平。本實驗在前期研究的基礎上進一步觀察了含噻唑烷酮的糖類衍生小分子CH1b對活動期RA患者的iNKT細胞的影響。結果顯示：與對照組和α-Galcer組相比，CH1b組iNKT細胞增殖率明顯增加，說明CH1b能促進IL-2引起的iNKT細胞增殖，提示CH1b能促進活化后的iNKT細胞增殖。

iNKT細胞活化后能夠迅速釋放大量Th1、Th2代表性細胞因子(IFN-γ、IL-4)和其他細胞因子，調控免疫細胞分化方向，發揮重要的免疫調節作用。iNKT細胞既可以分泌IFN-γ誘導Th0向Th1分化、激活免疫細胞的殺傷活性而促進細胞免疫應答，也可以分泌IL-4誘導Th0向Th2分化，促進B淋巴細胞活化增殖，提升體液免疫應答。iNKT細胞活化后引起的免疫反應極具多向性，因此IFN-γ/IL-4比值能夠作為反映iNKT細胞分泌細胞因子傾向性的良好指標[10]。實驗結果顯示：α-Galcer能促進iNKT細胞IL-4和IFN-γ的分泌，IFN-γ/IL-4顯著提高；CH1b能顯著性促進IL-4的分泌，而對IFN-γ分泌的影響不明顯，IFN-γ/IL-4顯著降低。說明α-Galcer刺激iNKT細胞分泌細胞因子具有明顯Th1傾向，能誘導Th0向Th1方向分化；而CH1b刺激iNKT細胞分泌細胞因子具有明顯Th2傾向，能誘導Th0向Th2方向分化。提示了CH1b對iNKT細胞因子分泌的影響對于糾正RA患者Th1/Th2平衡紊亂可發揮重要的調節作用。

我們通過進一步檢測各組iNKT細胞中IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA表達，從分子水平上驗證了上述結論。與對照組相比，CH1b組IL-4 mRNA的表達明顯增高。提示CH1b主要通過上調IL-4 mRNA的表達影響iNKT細胞免疫調節功能，對改善活動期RA的Th1極化而Th2抑制的狀態具有重要意義。

綜上所述，CH1b能夠促進IL-2活化的iNKT細胞體外增殖；增加iNKT細胞IL-4分泌、降低IFN-γ/IL-4；表明CH1b具有促進iNKT細胞增殖活性、增強iNKT細胞免疫調節功能和下調疾病炎性指標的潛質，可能在抗腫瘤、抗感染和治療自身免疫性疾病中具有重要作用。但iNKT細胞對免疫調節劑CH1b的識別方式及CH1b作用于iNKT細胞關鍵機制有待于進一步更深入的研究。

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[收稿2015-05-12修回2015-07-07]

(編輯倪鵬)

Effcets on immunoregulation of iNKT cells in RA by novel synthetic immunostimulator CH1b

MENGMing,ZHANGXue-Jiao,WENGPei-Shan,XUMing-Hua,CHENDan，HOUMing-Hui,CHENDong-Zhi.SchoolofMedicine,HebeiUniversity,Baoding071000，China

[Abstract]Objective:To investigate effects of a novel synthetic immunostimulator CH1b containing thiazolidin-4-one on the immunoregulation funotion of iNKT(invariant nature killer T) cells in active RA patients in vitro. Methods: Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) isolated from active RA patients were cultured with stimulation of α-Galcer and IL-2 in vitro and iNKT cells were then separated by using magnetic activated cell sorting(MACS)method with iNKT isolation kit.The cells were divided into three groups:control group (IL-2),α-Galcer group (IL-2+α-Galcer),CH1b group(IL-2 +CH1b).The effects of CH1b on the proliferation of iNKT cells in active RA patients were analyzed by using MTT assay.MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine kit was used to evaluate the secretion of IFN-γ and IL-4 in iNKT cells culture media.The expressions of IFN-γ mRNA and IL-4 mRNA in iNKT cells were analyzed by RT-PCR. Results: Compared with control and α-Galcer group,the proliferation of iNKT cells of CH1b group were significantly higher(P<0.05).Compared with control,the ratio of IFN-γ/IL-4 in iNKT cells culture media in active RA patients of CH1b group were significantly lower (P<0.05).Compared with control，expressions of IFN-γ mRNA and IL-4 mRNA were higher in α-Galcer group;compared with control,expressions of IL-4 mRNA were higher in CH1b group,while there were no obvious difference on expressions of IFN-γ mRNA. Conclusion: CH1b was found to significantly stimulate the actived iNKT cells in active RA patients proliferation，promote the secretion of IL-4，and increase the ratio of IFN-γ/IL-4,promote the expression of IL-4 mRNA in iNKT cells in active patients.

[Key words]Rheumatoid arthritis(RA);Invariant nature killer T(iNKT);Immunostimulants;IFN-γ/IL-4

作者簡介：孟明(1964年-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事免疫調節與自身免疫病方面研究，E-mail:mengming127@163.com。

通訊作者③，E-mail:chenddzz@163.com。

中圖分類號R392.12R256R979.5
①本文為國家自然科學基金(NSFC)(81373197)、河北省自然科學基金(H2014201133，H2015201131)、河北大學國家級大學生創新項目(201410075007)。
②河北大學附屬醫院，保定071000。

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0218-05