敲低IK1鉀通道抑制ClC-3氯通道的表達和功能*

鄒麗莉，　葉　東，　呂瑞玲，　汪　源，　孫曉雪，　朱林燕，　陳麗新△，　王立偉△

(暨南大學醫學院 1生理學系， 2藥理學系，廣東 廣州 510632； 3廣東藥學院基礎學院，廣東 廣州 510006)

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敲低IK1鉀通道抑制ClC-3氯通道的表達和功能*

鄒麗莉1▲，葉東3▲，呂瑞玲1，汪源2，孫曉雪2，朱林燕2，陳麗新2△，王立偉1△

(暨南大學醫學院1生理學系，2藥理學系，廣東 廣州 510632；3廣東藥學院基礎學院，廣東 廣州 510006)

[摘要]目的： 探討ClC-3氯通道是否為IK1鉀通道的調節靶點，重點研究鼻咽癌細胞IK1鉀通道對ClC-3氯通道功能及蛋白表達的影響。方法: 采用siRNA轉染技術抑制低分化鼻咽癌上皮細胞(CNE-2Z)IK1基因的表達；real-time PCR技術檢測ClC-3 mRNA的表達；Western blot檢測ClC-3的蛋白表達；細胞免疫熒光結合激光共聚焦顯微鏡技術檢測ClC-3和IK1蛋白在細胞內分布；全細胞膜片鉗記錄細胞氯電流。結果: IK1 siRNA可以成功轉染CNE-2Z細胞，有效抑制鼻咽癌細胞IK1鉀離子通道的表達；用IK1 siRNA抑制鼻咽癌細胞IK1鉀離子通道的表達后， ClC-3的mRNA表達上調而ClC-3蛋白卻表達減少：在低分化鼻咽癌上皮細胞，低滲刺激可激活氯通道，產生一個較大的氯電流，在成功轉染IK1 siRNA的細胞，此氯電流明顯減弱。結論: 敲低IK1鉀離子通道可抑制ClC-3氯離子通道的表達和功能。

[關鍵詞]ClC-3氯通道； IK1鉀通道； 鼻咽癌; 膜片鉗技術

細胞生長、分化和凋亡失去調控等多種因素都可能導致細胞生長發展失去既定的程序和缺乏分化而異常增生，最終導致腫瘤的發生。相對正常細胞而言，腫瘤細胞生長旺盛并且與人體正常的機能代謝不協調，并可遷移以及進一步侵犯正常組織和器官。腫瘤細胞往往處于一種增殖迅速、低分化程度的狀態。細胞周期調控在細胞增殖、分化、凋亡和癌變等生理病理過程起基礎作用，腫瘤的發生發展中的關鍵問題之一就是細胞周期失去調控。

細胞周期的調控是一個異常復雜而精密的過程。我們前期的研究表明，用氯通道阻斷劑能降低細胞的增殖，使處于G0/G1期的細胞百分比增加。此外，氯通道還參與細胞分化、凋亡和遷移等[1-2]， ClC-3氯離子通道蛋白被認為是容積敏感性氯通道候選蛋白之一[3-7]，參與細胞的多種生理活動。有研究表明ClC-3氯離子通道作為周期蛋白cyclin D1的作用靶點參與細胞周期的調控[8]，提示ClC-3氯離子通道對于細胞的增殖必不可少且是細胞周期調節中的關鍵因素之一。鉀離子通道是分布最廣泛的陽離子通道之一，存在于大多數的生物細胞中，參與諸多的細胞生物功能。IK1鉀離子通道廣泛表達于多種細胞[9]。IK1鉀離子通道基因表達受抑制后細胞增殖能力減弱并且細胞周期停滯于G0/G1期[10-14],提示IK1鉀離子通道參與細胞增殖和細胞周期的調控。

ClC-3氯離子通道是細胞通過G1-S期關卡的關鍵因素之一，IK1鉀離子通道作為體內常見的陽離子通道也參與細胞的周期調控，在調控細胞從G0/G1期進入S期起決定性作用。這2種離子通道在細胞周期調控中都起關鍵性作用，但目前這2種通道間的關系尚不清楚。本研究旨在探索在細胞周期調控中ClC-3氯通道是否為IK1鉀通道的調節靶點，試圖從離子通道之間調控作用的角度探討細胞周期調控，拓展對細胞周期調控機制的理解和認識。

材料和方法

1細胞

本課題的研究對象為人鼻咽癌上皮細胞株 CNE-2Z，由廣東醫學院病理教研室惠贈后于本室長期保存。

2主要試劑

ATP購自Gibco；脂質體LipofectamineTM2000購自Invitrogen；三羥甲基氨基甲烷購自Amresco；兔抗IK1多抗、鼠抗ClC-3單抗均購自Abcam；BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL化學發光試劑購自中國碧云天生物技術研究所；偶聯辣根過氧化物酶羊抗小鼠IgG購自北京博奧森生物技術有限公司；偶聯辣根過氧化物酶羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。

3主要方法

3.1細胞培養用含有10%新生小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的1640培養液培養CNE-2Z細胞，置于5% CO2、37 ℃培養箱中，48 h后傳代。

3.2轉染IK1 siRNA取處于對數生長期的人低分化鼻咽癌上皮細胞進行消化，并用不含有抗生素的1640培養液接種于6孔板中，24 h后取出孔板換液，并將siRNA和轉染試劑混勻成的轉染復合體加至培養板中進行轉染，在正常培養條件下繼續培養。siRNA終濃度為100 nmol/L。本研究使用的IK1 siRNA為對應于人體來源的IK1鉀離子通道基因的siRNA雙鏈，正義鏈序列為5’-GCCGUGCGUGCAGGAUUUA-3’，反義鏈序列為5’-UAAAUCCUGCACGCACGGC-3’；無序siRNA正義鏈序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈序列為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。本實驗同時設立空白對照組、轉染試劑組、無序對照組和IK1 si-RNA轉染組。

3.3IK1 siRNA轉染率檢測由于本研究使用的IK1 siRNA標記有5-FAM綠色熒光基團，轉染成功的細胞在熒光顯微鏡下能檢測到綠色熒光。在轉染細胞繼續培養24 h后用無菌PBS洗3次，再用熒光顯微鏡觀測熒光強度并分析轉染效率。

3.4Real-time PCR檢測 IK1鉀通道mRNA的表達轉染siRNA后繼續培養36 h，常規方法提取細胞總RNA，對提取的總RNA進行定量、逆轉錄，加入2×qPCR Taq Mix 12.5 μL，10 μmol/L各基因上、下游引物混合物0.5 μL，cDNA模板1 μL，加DEPC水補齊至25 μL； 振蕩混勻，置于Bio-Rad PCR儀中；設定條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，65 ℃ 40 s，44個循環。用Bio-Rad軟件分析所得數據。

3.5Western blot檢測IK1鉀通道蛋白的表達轉染siRNA 48 h后繼續培養48 h，常規方法提取細胞總蛋白，將得到的總蛋白采用BCA蛋白定量試劑盒定量分析后變性，然后行10% SDS-PAGE和半干轉膜、5%脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃孵育 I 抗過夜；TBST洗3次后室溫孵育 II 抗1 h；TBST洗3次，ECL化學發光顯影。掃描儀掃描得到圖片并用ImageJ軟件分析圖像。

3.6流式細胞術常規培養細胞并消化，種入6孔板中，置入細胞培養箱中12 h；轉染IK1 siRNA繼續培養48 h，無菌PBS洗孔板中的細胞3次，每次1 min，胰酶消化使細胞變成單個細胞懸浮液，收集細胞移入新的干凈無菌EP管中，800 r/min離心5 min，去上清液；加入無菌PBS，輕柔吹打混勻后800 r/min 離心5 min；再重復上一步2次；加入70%乙醇，輕柔吹打混勻，使細胞重新呈單個細胞懸浮狀態；4℃固定1 h；BD流式細胞儀檢測細胞周期分布。

3.7細胞免疫熒光實驗常規培養CNE-2Z細胞并消化成單個細胞的懸浮液，將細胞懸浮液滴在干凈的無菌圓形載玻片上，放入培養箱中正常培養6 h完成細胞爬片。用4%的多聚甲醛滴在爬片上，加0.5 mL 0.5% Triton X-100至玻片，室溫靜置20 min，滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；滴加足夠量的稀釋好的 I 抗并放入濕盒，4 ℃孵育過夜；取出玻片，去除 I 抗，放入暗室并滴加稀釋好的熒光 II 抗，濕盒中室溫避光孵育1 h；滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，中性樹脂封邊，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

3.8膜片鉗實驗用全細胞膜片鉗技術記錄氯電流，指令電壓按照0 mV、±40 mV、±80 mV反復循環，每個鉗制脈沖波寬為200 ms, 間隔時間為4 s。等滲灌流液(300 mOsm/L)配方：70 NaCl，0.5 MgCl2，2 CaCl2,10 Hepes，140 D-mannitol；47%低滲灌流液(160 mOsm/L)不含D-mannitol，其它成分與等滲液相同；電極內液含：70 N-methyl-D-glucamine chloride，1.2 MgCl2，1 EGTA，10 Hepes，140 D-mannitol，2 ATP。所有配制液體中所用試劑單位均為mmol/L。灌流液和電極內液的pH值分別調至7.4 和7.2。

4統計學處理

用SPSS 12.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數間比較采用Student-Newman-Keuls檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結果

1IK1 siRNA轉染CNE-2Z細胞的轉染率

用帶5-FAM綠色熒光基團的IK1 siRNA轉染細胞并培養12 h后觀測轉染率。空白對照組細胞并未轉染IK1 siRNA，無綠色熒光；IK1 siRNA轉染組細胞在熒光照射下出現大量綠色熒光，說明IK1 siRNA成功轉染進入鼻咽癌上皮細胞，見圖1。

Figure 1.Transfection efficiency of IK1 siRNA observed under fluorescence microscope in poorly differentiated nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells(×10).

圖1熒光顯微鏡下觀察IK1 siRNA轉染低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞的轉染效率

2IK1 siRNA抑制IK1鉀通道蛋白的表達

在轉染IK1 siRNA并培養48 h后，冰上裂解細胞并收集總蛋白，用Western blot檢測蛋白含量。結果如圖2所示，轉染試劑對照組(Lipo組)IK1蛋白的表達和無序列siRNA對照組(negative siRNA組)與空白對照組(control組)相比較，差異無統計學意義。IK1 siRNA組與空白對照組相比，IK1蛋白表達明顯減少(P<0.05)。Real-time PCR的結果顯示，IK1 siRNA組的IK1 mRNA較control組減少(79.3±2.5)%(P<0.01)，結果未顯示。

Figure 2.Inhibition of IK1 protein expression by IK1 siRNA in the CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖2IK1 siRNA抑制CNE-2Z細胞中IK1鉀通道蛋白的表達

3IK1 siRNA轉染促進ClC-3 mRNA的表達

轉染siRNA后36 h,IK1 siRNA組ClC-3 mRNA較control組增加90% (P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The increase in the mRNA expression of ClC-3 by IK1 siRNA in the CNE-2Z cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖3IK1 siRNA促進CNE-2Z細胞ClC-3 mRNA的表達

4IK1 siRNA轉染使細胞內ClC-3綠色熒光減弱

激光共聚焦顯微鏡下觀察免疫熒光，藍色為細胞核，綠色為ClC-3氯通道蛋白，紅色為IK1鉀通道蛋白。如圖4所示，對照組細胞中可以檢測到帶綠色熒光的ClC-3氯通道蛋白，而且在細胞核和細胞膜上分布較多。與對照組細胞的紅色熒光相比較，IK1 siRNA組細胞的紅色熒光明顯減弱，提示IK1 siRNA能有效抑制IK1蛋白在細胞內的表達。IK1 siRNA組細胞中可以檢測到較弱帶綠色熒光的ClC-3氯通道蛋白，其綠色熒光明顯弱于對照組，表明IK1鉀通道蛋白表達被抑制后，ClC-3氯通道蛋白的表達受到抑制。

5IK1 siRNA抑制CNE-2Z細胞內ClC-3蛋白的表達

Western blot結果顯示，與空白對照組相比， IK1 siRNA組ClC-3蛋白表達減少(P<0.05)，這提示IK1鉀離子通道可調控ClC-3氯離子通道蛋白的表達，見圖5。

6IK1 siRNA抑制CNE-2Z細胞氯電流

在空白對照組，細胞外灌流47%等滲液可激活氯通道。在鉗制電壓為-80 mV時，記錄到的氯電流平均電流密度為(-55.2±7.2)pA/pF， +80 mV時的平均電流密度為(78.0± 4.3)pA/pF，此電流可被胞外灌流氯通道阻斷劑DIDS (100 μmol/L) 所抑制。在IK1 siRNA轉染48 h后的細胞，胞外灌流47%低滲灌流液激活的氯電流較為微弱，在鉗制電壓為-80 mV時，平均電流密度為(-22.5± 3.4)pA/pF， +80 mV時平均電流密度為(49.9± 5.7)pA/pF，胞外灌流氯通道阻斷劑DIDS (100 μmol/L)后，該氯電流基本被抑制，與空白對照組相比差異顯著(P<0.01)。結果表明IK1 siRNA轉染能有效抑制細胞的容積激活性氯電流，見圖6。

Figure 4.ClC-3 protein distribution detected by the confocal immunofluorescence microscopy in the CNE-2Z cells. DIC： differential interference contrast image.

圖4激光共聚焦顯微鏡下檢測ClC-3蛋白的細胞內分布

Figure 5.The effects of IK1 siRNA on the protein expression of ClC-3 in the CNE-2Z cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖5IK1 siRNA對ClC-3蛋白表達的影響

討論

氯離子通道參與細胞周期的調控、細胞分化、細胞遷移和細胞凋亡[15-21]，氯離子通道阻斷劑能導致細胞周期的停滯和使細胞增殖減少[1]，提示氯離子通道在細胞周期和細胞增殖過程中發揮重要作用。ClC-3氯離子通道作為電壓門控氯離子通道，是具有容積敏感性的氯離子通道之一[22-26]，對細胞的生命活動是必不可少的，ClC-3氯離子通道蛋白的表達呈現周期依賴性，ClC-3氯離子通道參與調節細胞體積、細胞分化和細胞凋亡。我們的前期研究表明，沉默ClC-3氯離子通道能抑制細胞增殖并且使細胞停滯在G0/G1期，提示在細胞周期進程中，ClC-3氯離子通道是調節細胞通過G1-S關卡的關鍵因素之一，參與細胞周期的調控。

鉀離子通道作為體內最多的陽離子通道在很多研究領域并不陌生，鉀離子通道蛋白在增殖較活躍的細胞中表達增多，鉀離子通道阻斷劑能阻斷細胞周期進程并且抑制細胞的增殖。IK1基因被下調后，細胞的增殖受抑制，使用siRNA沉默IK1鉀離子通道基因后，能阻斷細胞周期進程并且使細胞增殖受到抑制。這些都提示IK1鉀離子通道在細胞周期進程中是必不可少。

Figure 6.Inhibition of hypotonicity (Hypo)-activated chloride current by IK1 siRNA in the CNE-2Z cells.Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol.

圖6IK1 siRNA抑制細胞低滲激活的氯電流

目前已知ClC-3氯離子通道和IK1鉀離子通道參與細胞周期的調控，但這2種通道間的關系并不清楚。本研究究旨在探索IK1鉀離子通道對ClC-3氯離子通道是否具有調控作用，從離子通道之間的調控作用的全新出發點來探索腫瘤細胞的周期調控。結果顯示，IK1 siRNA能被成功轉染進入低分化鼻咽癌上皮細胞，并且有效抑制IK1鉀離子通道蛋白的表達，表明所設計的siRNA可有效干擾鼻咽癌細胞IK1基因的表達。

Real-time PCR結果提示，在細胞的mRNA水平，低表達IK1能使細胞ClC-3在基因水平表達增高，即IK1鉀離子通道在mRNA水平對ClC-3氯離子通道具有負調控作用。用免疫熒光技術在激光共聚焦顯微鏡下觀察不同組內細胞中ClC-3 蛋白的分布情況，結果顯示，與空白對照組相比， IK1 siRNA組細胞中的ClC-3綠色熒光較弱，提示了IK1 siRNA能抑制細胞中ClC-3蛋白的表達，也就是說IK1的低表達使ClC-3蛋白質表達減少，IK1鉀離子通道蛋白對ClC-3氯離子通道蛋白的表達具有正調控作用，這種調控作用在Western blot分析中得到進一步的證實。Western blot結果表明，IK1 siRNA可抑制ClC-3蛋白的表達，即低表達IK1后ClC-3蛋白的表達受到抑制。在上述結果中，IK1 siRNA促進了ClC-3 mRNA的表達卻抑制了ClC-3蛋白的表達。這可能與真核細胞基因的表達過程中，基因的轉錄和翻譯是2個不同的過程，在某些特定的條件下脫節相關。在轉錄和翻譯2個水平，同一個基因可以有不同的轉錄本，而且mRNA可以有不同的剪接方式，因此一個基因可以有多個蛋白質。基因轉錄至mRNA后再到蛋白質還有眾多的調控，從ClC-3的 mRNA到ClC-3 蛋白是一個復雜的調控過程，可能ClC-3 mRNA沒有翻譯為蛋白就降解了，也可能翻譯到一定水平后，獲得另外的信號，而停止翻譯從而導致ClC-3 mRNA的表達水平升高而ClC-3蛋白表達水平下降的結果。ClC-3 mRNA在成功翻譯為ClC-3 蛋白之后還存在一個翻譯后加工問題，如果翻譯后加工不正確，ClC-3 蛋白可能被內肽酶降解，也有可能活性降低，而導致最終ClC-3蛋白表達水平下降。在ClC-3蛋白受到抑制而表達水平下降后，細胞可能在mRNA水平反饋調節，最終導致ClC-3蛋白表達水平降低而mRNA的表達水平升高。

全細胞膜片鉗記錄細胞容積激活性氯通道的結果表明，IK1 siRNA作用組的細胞與空白對照組的細胞相比，其容積激活性氯電流明顯減小，說明IK1 siRNA可抑制細胞容積激活性氯電流，進一步提示敲低IK1 鉀通道可以抑制氯通道的功能。

綜上所述， 敲低IK1鉀離子通道對ClC-3氯離子通道的表達和功能可能具有抑制作用。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81171741)

Knockdown of IK1 potassium channel inhibits expression and function of ClC-3 chloride channelZOU Li-li1, YE Dong3, Lü Rui-ling1, WANG Yuan2, SUN Xiao-xue2, ZHU Lin-yan2, CHEN Li-xin2, WANG Li-wei1

(1DepartmentofPhysiology,2DepartmentofPharmacology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3SchoolofBasicCourses,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China.E-mail:twangliwei@jnu.edu.cn;tchenlixin@jnu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To investigate whether the ClC-3 chloride channel is an acting target of the IK1 potassium channel, and to study the action of IK1 potassium channel on the functional activities and expression of ClC-3 chloride channels. METHODS: IK1 gene was silenced by IK1 siRNA in poorly-differentiated nasopharyngeal carcinoma cells (CNE-2Z). Real-time PCR and Western blot were used to detect the expression of ClC-3 at mRNA and protein levels. The distribution of ClC-3 protein in the cells was observed under confocal immunofluorescence microscope. The chloride current was recorded by the patch-clamp technique. RESULTS: IK1 siRNA was successfully transfected into the CNE-2Z cells and knocked down the expression of IK1 potassium. The mRNA expression of ClC-3 was increased by the IK1 siRNA. IK1 siRNA inhibited the expression of ClC-3 protein. A chloride current was activated by hypotonic challenges, and the hypotonicity-induced current was reduced in the cells which successfully transfected with IK1 siRNA. CONCLUSION: The knockdown of IK1 potassium channels inhibits the expression and function of ClC-3 chloride channel.

[KEY WORDS]ClC-3 chloride channel; IK1 potassium channel; Nasopharyngeal carcinoma; Patch-clamp techniques

通訊作者△Tel: 0313-3042224； E-mail: drduanyonggang@126.com

[收稿日期]2015- 06- 08[修回日期] 2015- 10- 12

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2120- 06

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.001

[中圖分類號]R730.23; R33-33

[文獻標志碼]A