RNAi介導的IGF1R基因沉默對肝癌細胞生長、遷移與侵襲的影響*

別彩群，　黃秋燕，　顏　英，　石　珩，　湯紹輝△

(1廣州醫科大學附屬深圳沙井醫院消化內科，廣東 深圳 518104； 2暨南大學附屬第一醫院消化內科，廣東 廣州 510630)

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RNAi介導的IGF1R基因沉默對肝癌細胞生長、遷移與侵襲的影響*

別彩群1，黃秋燕2，顏英2，石珩2，湯紹輝2△

(1廣州醫科大學附屬深圳沙井醫院消化內科，廣東 深圳 518104；2暨南大學附屬第一醫院消化內科，廣東 廣州 510630)

[摘要]目的： 研究RNA干擾(RNAi)介導的胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)基因沉默對肝癌細胞生長、遷移與侵襲的影響。方法: 設計并篩選抑制IGF1R mRNA表達效率最高的siRNA序列，構建該序列的慢病毒表達載體，轉染293T細胞進行病毒包裝。將包裝好的慢病毒感染Huh7和Hep3B肝癌細胞，篩選沉默IGF1R基因表達的穩定細胞株。將上述穩定細胞株擴大培養，檢測細胞IGF1R mRNA表達變化，細胞生長、遷移與侵襲能力變化，以及Ki-67、p-AKT、p-ERK1、Gli1、β-catenin、cyclin D1、p21、BCL-XL的蛋白表達水平變化。結果: 與空白及陰性對照組比較，感染攜帶IGF1R干擾序列慢病毒的Huh7和Hep3B肝癌細胞IGF1R mRNA表達水平顯著下調，細胞增殖活性明顯降低，細胞凋亡顯著增加，細胞遷移和侵襲能力明顯受到抑制，細胞中IGF1R、Ki-67、p-AKT、p-ERK1、Gli1、β-catenin、cyclin D1、p21及BCL-XL蛋白表達水平均顯著降低。結論: RNAi介導的IGF1R基因沉默可明顯抑制Huh7和Hep3B肝癌細胞生長及惡性生物學特征，這可能與IGF1R表達水平顯著下調而引起上述調控細胞增殖、抗凋亡基因以及相關信號通路基因的蛋白表達水平顯著降低有關。

[關鍵詞]RNA干擾； 胰島素樣生長因子1受體； 肝細胞癌

胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)是一種酪氨酸激酶跨膜蛋白，由2個α亞單位和2個β亞單位構成。IGF1R廣泛表達于多種類型的細胞表面，參與介導胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)和主要的IGF2的生物學功能，與細胞的增殖分化、胚胎的發育密切相關[1]。近年研究表明，IGF1R在多種惡性腫瘤包括肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的表達水平明顯上調，IGF1R的過表達可能成為惡性腫瘤基因治療的新靶點[2-3]。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)所誘導的一種特異性基因沉默現象。本研究構建針對IGF1R基因的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)前體——短發夾RNA(short harpin RNA，shRNA)的慢病毒載體，感染Huh7和Hep3B肝癌細胞，觀察對肝癌細胞生長、遷移與侵襲能力的影響及其機制。

材料和方法

1材料

LipofectamineTMRNAiMAX轉染試劑及LipofectamineTM2000轉染試劑購于Invitrogen，SYBR Green PCR Master Mix購于TOYOBO，PLVX-shRNA2載體購于Clontech，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒購于Keygen，TRIzol試劑及細胞增殖檢測試劑購于Promega，Huh7和HepG3B肝癌細胞株、HL-7702、293T細胞株購自武漢大學中國典型培養物保藏中心，抗IGF1R、抗Ki-67、抗p-ERK1、抗Gli1、抗p-AKT、抗cyclin D1、抗β-catenin、抗p21、抗BCL-XL及抗GAPDH抗體購于Abcam。

2方法

2.1針對IGF1R基因的siRNA設計與篩選根據 siRNA 設計原則，參照IGF1R mRNA序列設計并合成3對siRNA序列(IGF1R_001、IGF1R_002、IGF1R_003)及1對無任何靶基因的siRNA，即陰性對照siRNA(negative control siRNA, NC siRNA)。培養Huh7肝癌細胞至匯合度為30%～50%，采用LipofectamineTMRNAiMAX轉染試劑進行細胞轉染siRNA。實驗分為4個組，即NC siRNA組和3個實驗組(IGF1R_001、IGF1R_002和IGF1R_003)，每組設置25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L 3個siRNA濃度梯度。轉染24 h后，按TRIzol試劑盒說明抽提Huh7細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA并進行定量PCR擴增。IGF1R mRNA上游引物為5’-TTT CCC TTT GGA GTG TAG CT-3’，下游為5’-CAT TGG CTG TGC AGT CAA G-3’，片段長度為180 bp；以18S rRNA為內參照。每個樣本同時擴增3 復管，并連續進行3次實驗。采用相對定量法( 2-ΔΔCt) 表示目的基因表達量。

2.2針對IGF1R基因的RNA干擾慢病毒載體構建(1)篩選得到的高效沉默IGF1R基因的干擾序列為IGF1R_002：正義鏈為5’-CUG ACU ACA GGG AUC UCA UdTdT-3’，反義鏈為5’-AUG AGA UCC CUG UAG UCA GdTdT-3’。IGF1R基因靶序列為5’-CTG ACT ACA GGG ATC TCA T-3’。(2)設計表達IGF1R_002的shRNA序列：上游序列為5’-GATCC CTG ACT ACA GGG ATC TCAT TCA AGA GAT GAG ATC CCT GTA GTC AGT TTT TTT G-3’，下游序列為5’-AATTC AAA AAA ACT GAC TAC AGG GAT CTC ATC TCT TGA ATG AGA TCC CTG TAG TCA GG-3’(上游序列含BamH Ⅰ酶切位點，下游序列含EcoR Ⅰ酶切位點)。(3)雙鏈IGF1R_002制備：將表達IGF1R_002的上游序列與下游序列等體積混合后，沸水浴中煮沸 5 min，然后 72 ℃ 15 min，自然冷卻至室溫。此時即可與載體連接，或-20 ℃ 保存。(4)取pLVX-shRNA2 載體行BamH Ⅰ與EcoR Ⅰ雙酶切，酶切產物與雙鏈IGF1R_002連接，構建成pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒載體。重組載體送華大基因公司進行測序分析。

2.3pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒包裝及滴度測定轉染前24 h，調整293T細胞密度(5×106)重新接種于10 cm 細胞培養皿，置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養。24 h后，細胞密度達70%～80%時即可用于轉染。將各DNA溶液(pLVX-shRNA2-IGF1R_002載體20 μg，pHelper 1.0 載體15 μg，pHelper 2.0 載體10 μg)、LipofectamineTM2000試劑與Opti-MEM 混合均勻，在室溫下溫育20 min。將混合液轉移至293T細胞培養液中，培養8 h后，以PBS液洗滌殘余的轉染混和物，加入含10%胎牛血清的細胞培養基繼續培養48 h。收集細胞上清液，經過離心和過濾收集病毒濃縮液，-80 ℃保存。取其中一支，采用倍比稀釋法檢測病毒滴度，取最佳病毒滴度做后續實驗。

2.4pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒感染Huh7和HepG3B肝癌細胞感染前24 h，取對數生長期的Huh7和HepG3B細胞分別按每孔2×105接種于24孔板，置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養。24 h后，細胞密度達40%～50%時，加入各組包裝好的慢病毒及合適濃度的Polybrene。實驗分3組，每組設3個復孔，即pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒組(感染pLVX-shRNA2-IGF1R_002的Huh7和HepG3B細胞，簡稱IGF1R siRNA組)、空載體慢病毒組(感染pLVX-shRNA2空載體的Huh7和HepG3B細胞，簡稱negative control組)及空白對照組(未感染任何病毒的Huh7和HepG3B細胞，簡稱blank control組)。感染12 h后棄上清，更換為新鮮的完全培養基，72 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞，檢測GFP蛋白表達情況，挑選熒光強度大的陽性克隆孔逐級擴大培養，即可得到沉默IGF1R表達的穩定細胞株，用于后續實驗。

2.5IGF1R mRNA表達檢測培養上述3組細胞，48 h后收集細胞，按TRIzol試劑盒說明抽提細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA并進行實時熒光定量PCR分析。IGF1R mRNA擴增引物同前，采用相對定量法( 2-ΔΔCt) 表示目的基因表達量。

2.6細胞增殖檢測取上述3組細胞，調整細胞濃度為1×108/L，分到96孔板，每孔100 μL。收集各個時點的細胞(0 h、24 h、48 h、72 h)，加入MTS。孵育4 h后，酶標儀測定 490 nm處吸光度(A)值。

2.7細胞周期檢測培養上述3組細胞48 h后，每組離心收集1×106細胞，用PBS洗細胞2次，加入預冷70%乙醇，于4 ℃固定過夜。1 000×g離心5 min收集細胞，用PBS洗細胞1次，加入含50 mg/L溴化丙啶和100 mg/L RNase A的PBS，4 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測熒光強度。

2.8細胞凋亡檢測培養上述3組細胞48 h后，離心收集細胞，用培養基重懸細胞，使其濃度為1×109/L。取0.5 mL細胞懸液，加入1.25 μL Annexin V-FITC，置于室溫避光反應時間為15 min。室溫1 000×g離心5 min收集細胞，用0.5 mL 預冷的1×結合緩沖液輕輕重懸，加入10 μL 碘化丙啶，置于冰上避光保存，用流式細胞儀檢測熒光變化。

2.9細胞遷移和侵襲檢測對于細胞遷移實驗，取上述3組細胞，計數，調整細胞濃度為1×109/L，取細胞懸液100 μL加入Transwell小室上室，下室加入600 μL完全培養基。在37 ℃、5% CO2孵育24 h后，取出小室，棄去培養液，用棉簽擦去上室未遷移的細胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色10 min，PBS洗滌3次并晾干，顯微鏡下觀察 6個視野細胞并拍照計數。對于細胞侵襲實驗，首先用Matrigel膠包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃ 30 min使Matrigel聚合成凝膠，使用前進行基底膜水化，其余步驟同遷移實驗。

2.10蛋白表達檢測培養上述3組細胞48 h后，離心收集細胞，制備細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，行SDS-PAGE，轉硝酸纖維素膜，用脫脂奶粉封閉。加入稀釋的I抗(抗IGF1R、抗Ki-67、抗p-ERK1、抗Gli1、抗p-AKT、抗cyclin D1、抗β-catenin、抗p21、抗BCL-XL及抗GAPDH)、辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，增強化學發光顯影，凝膠成像系統攝像及分析結果。

3統計學處理

分類資料的比較采用χ2檢驗，計量資料的比較采用ANOVA或獨立樣本t檢驗，應用SPSS 13.0統計軟件進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1針對IGF1R基因的siRNA設計與篩選結果

本研究設計并合成了3對siRNA，即IGF1R_001、IGF1R_002及IGF1R_003，分別轉染Huh7肝癌細胞。轉染24 h后，熒光定量PCR檢測結果顯示，轉染IGF1R_001、IGF1R_002及IGF1R_003的Huh7細胞中IGF1R mRNA表達量均有不同程度的降低，抑制效率約為31.7%～78.6%，其中IGF1R_002在100 nmol/L濃度時抑制效率最高，達78.6%，將此siRNA用于后續研究。

2慢病毒載體構建、慢病毒包裝和滴度測定、穩定細胞株構建結果

根據篩選出的IGF1R_002，設計表達IGF1R_002的shRNA序列，克隆入pLVX-shRNA2 載體，構建成pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒載體，測序結果顯示插入片段序列正確。將構建好的慢病毒載體及2種病毒包裝輔助質粒共轉染293T細胞，轉染后48 h，在熒光顯微鏡下觀察細胞的轉染效率，幾乎所有293T細胞均發出較亮的綠色熒光，提示轉染效率高，病毒包裝成功，見圖1。采用倍比稀釋法檢測病毒滴度為2.78×1011TU/L。將包裝好的慢病毒感染Huh7和Hep3B肝癌細胞，挑選熒光強度大的陽性克隆孔逐級擴大培養，得到了沉默IGF1R基因表達的穩定細胞株，見圖2。

Figure 1.Green fluorescence photographs at 48 h after transfection with pLVX-shRNA2-IGF1R_002 lentiviral vector or negative control vector in 293T cells.

圖1pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒載體或陰性對照載體轉染293T細胞后48 h綠色熒光圖

Figure 2.Green fluorescence photographs in Huh7 and Hep3B cell lines with or withoutIGF1Rgene silencing.

圖2沉默及未沉默IGF1R基因表達的Huh7和Hep3B穩定細胞株熒光圖片

3IGF1R mRNA表達變化結果

圖3顯示，與正常肝細胞HL-7702相比，Huh7和Hep3B肝癌細胞IGF1R mRNA的表達水平顯著上調；感染攜帶IGF1R干擾序列(IGF1RsiRNA)的慢病毒后，與blank control及negative control組相比較，IGF1RsiRNA 組Huh7和Hep3B肝癌細胞的IGF1R mRNA表達水平明顯下調(P<0.01)。

Figure 3.Effect ofIGF1RsiRNA on IGF1R mRNA expression in Huh7 and Hep3B cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnegative control.

圖3IGF1RsiRNA對Huh7和Hep3B細胞IGF1R mRNA表達的影響

4細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡結果

與blank control及negative control組相比較，IGF1RsiRNA 組Huh7和Hep3B肝癌細胞的增殖明顯受到抑制，從轉染后第1至第3天差異均有統計學意義(P<0.01)；G1期細胞比例顯著增加，S期細胞比例顯著減少(P<0.01)；早期、晚期及總凋亡均顯著增加(P<0.01)，見圖4～6。

5細胞遷移和侵襲實驗結果

與blank control及negative control組相比較，IGF1RsiRNA 組Huh7和Hep3B肝癌細胞遷移能力和侵襲能力明顯受到抑制，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖7、8。

6Western blot分析結果

與blank control及negative control組相比較，IGF1RsiRNA 組Huh7和Hep3B肝癌細胞IGF1R、Ki-67、p-ERK1、p-AKT、 Gli1、β-catenin、cyclin D1、p21和BCL-XL蛋白的表達水平均顯著降低(P<0.01)，見圖9。

Figure 4.Effect ofIGF1RsiRNA on the proliferation of Huh7 and Hep3B cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsnegative control.

圖4IGF1RsiRNA對Huh7和Hep3B細胞增殖的影響

Figure 5.Effect ofIGF1RsiRNA on the cell cycle of Huh7 and Hep3B cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnegative control.

圖5IGF1RsiRNA對Huh7和Hep3B細胞周期的影響

Figure 6.Effect ofIGF1RsiRNA on apoptosis of Huh7 and Hep3B cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnegative control.

圖6IGF1RsiRNA對Huh7和Hep3B細胞凋亡的影響

Figure 7.Effect ofIGF1RsiRNA on the migration of Huh7 and Hep3B cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnegative control.

圖7IGF1RsiRNA對Huh7和Hep3B細胞遷移能力的影響

Figure 8.Effect ofIGF1RsiRNA on the invasion of Huh7 and Hep3B cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnegative control.

圖8IGF1RsiRNA對Huh7和Hep3B細胞侵襲能力的影響

討論

胰島素樣生長因子軸由IGF1、IGF2、IGF1R、IGF2R、胰島素受體及IGF結合蛋白組成，它們所介導的信號通路在細胞生長、增殖、分化、凋亡等方面發揮重要作用，其表達異常與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關[4]。IGF1R是細胞表面的酪氨酸蛋白激酶受體，它介導IGF1及主要的IGF2生物學功能[5]。研究表明，在HCC中，IGFs的失衡主要表現為IGF2和IGF1R過表達，且IGF2 mRNA 與IGF1R mRNA的表達水平呈正相關。IGF2與IGF1R結合后激活2條信號轉導通路，即PI3K/Akt和MAPK，進而促進細胞有絲分裂, 誘導細胞增生，抑制凋亡, 促進肝細胞惡性轉化[6-9]。因此，抑制IGF2或IGF1R過表達，干預該通路的活化有可能成為HCC治療的新靶點[10]。目前，有關應用小分子抑制劑如靶向IGF1R的RNAi， 進行HCC基因治療的研究非常少，且不夠深入。

在本研究中，我們根據siRNA設計原則，設計并合成了3對靶向IGF1R的siRNA序列，分別轉染Huh7肝癌細胞，結果篩選出IGF1R_002的抑制效率最高，達78.6%。將表達IGF1R_002的shRNA序列克隆入pLVX-shRNA2 載體，構建成pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒載體，經293T細胞包裝成功后，檢測病毒滴度為2.78×1011TU/L。將慢病毒感染Huh7和Hep3B肝癌細胞，挑選熒光強度大的陽性克隆孔逐級擴大培養，得到了沉默IGF1R基因表達的穩定細胞株。將上述穩定細胞株擴大培養，一系列細胞實驗結果顯示，感染攜帶IGF1R干擾序列慢病毒的Huh7和Hep3B肝癌細胞IGF1R mRNA表達水平顯著下調，細胞增殖活性明顯降低，細胞周期阻滯于G1期，細胞凋亡顯著增加，細胞遷移能力和侵襲能力明顯受到抑制。這些結果提示，應用RNA干擾技術沉默IGF1R基因表達可顯著抑制Huh7和Hep3B肝癌細胞的生長，降低其惡性生物學特征。進一步基因表達檢測結果顯示，感染攜帶IGF1R干擾序列慢病毒的Huh7和Hep3B肝癌細胞的IGF1R、細胞增殖相關蛋白Ki-67、PI3K/Akt和MAPK信號通路相關蛋白p-AKT及p-ERK1、Hedgehog信號通路相關蛋白(Gli1)、Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白β-catenin、細胞周期調控相關蛋白cyclin D1及p21、細胞凋亡抑制相關蛋白BCL-XL的表達水平均顯著降低。此結果提示：(1)Ki-67、AKT、ERK1、Gli1、β-catenin、cyclin D1、p21及BCL-XL基因可能是IGF1R的下游調控靶基因，一般情況下IGF1R對其可能是正向調控；(2)Huh7和Hep3B肝癌細胞中IGF1R的表達抑制可導致上述基因表達水平顯著降低，進而引起Huh7和Hep3B肝癌細胞生長繁殖明顯抑制，惡性生物學行為降低；(3)采用RNA干擾技術沉默IGF1R基因表達可能成為HCC基因治療的一個新靶點。

Figure 9.Effect ofIGF1RsiRNA on IGF1R and other protein expression in Huh7 and Hep3B cells. BL: blank control; NC： negative control; Si:IGF1RsiRNA. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnegative control.

圖9IGF1RsiRNA對Huh7和Hep3B細胞IGF1R和其它蛋白表達的影響

既往研究顯示，多條細胞信號通路的異常活化參與了HCC的發生發展，這些信號通路包括PI3K/Akt、MAPK、Hedgehog、Wnt/β-catenin、IGFs等[11-15]。此外，更為重要的是，在HCC的發生發展過程中，Hedgehog信號通路與PI3K/Akt、MAPK及Wnt/β-catenin信號通路之間存在著重要的交叉對話[15]，PI3K/Akt信號通路又可調控Wnt/β-catenin通路[16]，而Wnt/β-catenin通路也與PI3K/Akt、MAPK通路之間存在著交叉對話[17]。這些研究結果表明，在HCC中，PI3K/Akt、MAPK、Hedgehog、Wnt/β-catenin等信號通路之間相互影響、相互調控，共同影響肝癌的發生發展。在本研究中，沉默Huh7和Hep3B肝癌細胞IGF1R基因的表達，結果導致上述信號通路中關鍵分子的表達水平顯著下調，表明IGF1R可能調控PI3K/Akt、MAPK、Hedgehog、Wnt/β-catenin信號通路的活性，或提示IGF1R可能先影響上述一至二條信號通路的活性，再進一步通過交叉對話使其它通路的活性發生改變，共同促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學行為，目前國內外尚未見相似研究報道。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

*[基金項目]福建省衛生系統中青年骨干人才培養項目(No. 2013-ZQN-JC-2)；福建省科技計劃重點項目(No. 2014Y0009)

Effect of RNAi-mediatedIGF1Rgene silencing on growth, migration, and invasion of hepatocellular carcinoma cellsBIE Cai-qun1, HUANG Qiu-yan2, YAN Ying2, SHI Heng2, TANG Shao-hui2

(1DepartmentofGastroenterology,TheAffiliatedShenzhenShajingHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Shenzhen518104,China;2DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospital,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tangshaohui205@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of RNA interference (RNAi)-mediated insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) gene silencing on the growth, migration, and invasion of hepatocellular carcinoma cells. METHODS: The most effective siRNA targeting IGF1R gene was designed and screened. After lentiviral expression vector pLVX-shRNA2-IGF1R carrying the most effective siRNA sequence was constructed, it was transfected into 293T cells and packed into pLVX-shRNA2-IGF1R lentivirus. Huh7 and Hep3B cells were infected with the pLVX-shRNA2-IGF1R lentivirus to screen the positive clone Huh7 cells and Hep3B cells with the lentivirus. These Huh7 cells and Hep3B cells were cultured to analyze the mRNA level of IGF1R, cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis, cell migration/invasion, and the protein levels of IGF1R, Ki-67, p-AKT, p-ERK1, Gli1, β-catenin, cyclin D1, p21 and BCL-XL. RESULTS: The mRNA expression of IGF1R in Huh7 cells and Hep3B cells with pLVX-shRNA2-IGF1R lentivirus was significantly reduced. The proliferation of these cells was remarkably inhibited, and the number in G1phase was increased significantly. The percentages of apoptotic cells were increased markedly, and the number of cell migration/invasion was decreased markedly. The protein levels of IGF1R, Ki-67， p-AKT, p-ERK1, Gli1, β-catenin, cyclin D1, p21 and BCL-XL were decreased significantly compared with the blank control group and negative control group. CONCLUSION: The RNAi-mediated IGF1R gene silencing significantly suppresses the growth and the malignant biological characteristics of Huh7 cells and Hep3B cells, which may be involved in the reduced protein levels of the above genes induced by down-regulation of IGF1R expression.

[KEY WORDS]RNA interference; Insulin-like growth factor 1 receptor; Hepatocellular carcinoma

通訊作者△Tel： 0591-88216378； E-mail： hyi8070@126.com

[收稿日期]2015- 06- 15[修回日期] 2015- 09- 24

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2144- 07

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.005

[中圖分類號]R735； R730.23

[文獻標志碼]A