褐藻糖膠對RPMI 8226細(xì)胞血管生成的影響*

劉　芬，　肖　青△，　湯為學(xué)，　呂敬龍

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1血液科， 2中心實驗室，重慶 400016;3重慶市三峽中心醫(yī)院血液科 重慶 404000)

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褐藻糖膠對RPMI 8226細(xì)胞血管生成的影響*

劉芬1，肖青1△，湯為學(xué)2，呂敬龍3

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1血液科，2中心實驗室，重慶 400016;3重慶市三峽中心醫(yī)院血液科 重慶 404000)

[摘要]目的： 探討褐藻糖膠對多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞血管生成的影響及可能的作用機(jī)制。方法: 體外培養(yǎng)多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞及人血管內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy 926細(xì)胞，采用MTT法檢測褐藻糖膠對RPMI 8226細(xì)胞活力的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡率；ELISA法檢測褐藻糖膠處理RPMI 8226細(xì)胞后的培養(yǎng)液上清中VEGF的含量；小管形成實驗觀察褐藻糖膠處理RPMI 8226細(xì)胞后的培養(yǎng)液上清對EA.hy 926細(xì)胞誘導(dǎo)小管形成能力的影響；Western blot檢測HIF-1α、VEGF、p-AKT和p-ERK1/2的蛋白水平。結(jié)果: 褐藻糖膠對RPMI 8226細(xì)胞活力的抑制作用呈濃度及時間依賴性；褐藻糖膠作用RPMI 8226細(xì)胞72 h后，細(xì)胞周期被阻滯于G1期，細(xì)胞凋亡率呈濃度依賴性明顯增高，各組均高于對照組(P<0.05)；ELISA法結(jié)果顯示褐藻糖膠處理72 h后的細(xì)胞培養(yǎng)液上清中VEGF的含量明顯減少，與對照組相比，處理組上清中VEGF的含量下降(P<0.05)；內(nèi)皮細(xì)胞形成小管數(shù)目與面積隨著褐藻糖膠的濃度升高而減小，100 mg/L 組差異顯著(P<0.05)；Western blot結(jié)果顯示HIF-1α、VEGF、p-AKT和p-ERK1/2的蛋白水平與褐藻糖膠濃度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論: 褐藻糖膠減少骨髓瘤細(xì)胞自分泌VEGF，減弱血管內(nèi)皮細(xì)胞形成小管的能力，降低HIF-1α和VEGF的蛋白水平，這可能與抑制AKT和ERK1/2的磷酸化有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]褐藻糖膠； 多發(fā)性骨髓瘤； HIF-1α; VEGF; AKT; ERK1/2

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是漿細(xì)胞惡性增殖克隆性疾病，在血液腫瘤中發(fā)病率第二。盡管針對治療多發(fā)性骨髓瘤的新藥研究取得了較大的進(jìn)展，但是迄今為止多發(fā)性骨髓瘤仍然是一種難以治愈，并且易于復(fù)發(fā)的疾病，這使得尋求新的治療方法仍然是一大重要課題[1]。抗血管生成是近年腫瘤治療的研究熱點，在多發(fā)性骨髓瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha，HIF-1α)可以促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，繼而有效促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤血管生成，造成多發(fā)性骨髓瘤的難治、復(fù)發(fā)[2]。褐藻糖膠(fucoidan)是提取于褐藻中的水溶性多糖，主要結(jié)構(gòu)為L-巖藻糖和硫酸基，作為一種低毒藥物，褐藻糖膠對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性是目前研究的熱點。現(xiàn)已證明褐藻糖膠能夠有效抑制實體腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、促進(jìn)凋亡達(dá)到抗腫瘤作用[3]，同時，我們前期實驗證實褐藻糖膠能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株HL-60的凋亡[4]，但是其對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的血管生成是否有影響仍不清楚，因此我們試圖通過收集褐藻糖膠作用于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI 8226細(xì)胞后的細(xì)胞培養(yǎng)液上清，檢測VEGF的分泌量及誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成小管的能力，并檢測經(jīng)過處理的骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)HIF-1α與VEGF蛋白的改變，探討其可能的相關(guān)機(jī)制。

材料和方法

1細(xì)胞與主要試劑

多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226 細(xì)胞由上海長征醫(yī)院侯健教授惠贈；EA.hy 926細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年科李法琦教授惠贈。褐藻糖膠購于Sigma，純度為99.9%，PBS溶解成20 g/L儲存液，使用前用RPMI-1640培養(yǎng)液配成不同濃度工作液；RPMI-1640培養(yǎng)液、MTT和胰蛋白酶購于Sigma；胎牛血清購于Gibco；細(xì)胞周期檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購于凱基生物；人VEGF ELISA試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠和羊抗兔 II 抗購于博士德公司；Matrigel基質(zhì)膠購于Corning；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒和Western blot常規(guī)試劑均購于碧云天公司；PVDF膜購于Millipore；HIF-1α、VEGF兔抗人抗體購于Abcam；AKT、p-AKT、ERK1/2及p-ERK1/2兔抗人抗體購于CST。

2細(xì)胞培養(yǎng)與上清的收集

RPMI 8226細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中，約1～2 d后離心傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。EA.hy 926細(xì)胞培養(yǎng)條件同RPMI 8226細(xì)胞，約生長2 d后完全融合成單層細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

取對數(shù)生長期的RPMI 8226細(xì)胞，以含有2%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108/L，分別以不同濃度(0、25、50、100和200 mg/L)褐藻糖膠作用RPMI 8226細(xì)胞72 h，4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min，收集上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3主要方法

3.1MTT法檢測細(xì)胞活力取對數(shù)生長期RPMI 8226細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以4×107/L接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，分別加入等體積不同濃度的褐藻糖膠(使其藥物終濃度分別為25、50、100、200和400 mg/L)，每組設(shè)5個重復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后，每孔加入20 μL(5 g/L)MTT，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后小心吸盡上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)吹打混勻，避光條件下振蕩10 min待完全溶解后，用酶標(biāo)儀檢測570 nm處吸光度(A)。計算褐藻糖膠對細(xì)胞活力的抑制率(%) = (A對照組-A給藥組)/A對照組×100%，實驗重復(fù)3次。

3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡取對數(shù)生長期RPMI 8226細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108/L，接種6孔板中，每孔體積4 mL。空白對照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，實驗組加入等體積不同濃度褐藻糖膠(終濃度為25、50、100、200 mg/L)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，收集各組細(xì)胞，500 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次。70%冰乙醇固定5 h，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，Cell Quest分析細(xì)胞周期。同樣方法收集細(xì)胞后，將細(xì)胞重懸于500 μL binding buffer，再依次加入5 μL Annexin V/FITC和5 μL PI溶液，吹打均勻后，冰上、避光條件下反應(yīng)10 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，實驗重復(fù)3次。

3.3ELISA檢測自分泌VEGF的水平取對數(shù)生長期RPMI 8226細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108/L，接種6孔板中，每孔體積2 mL,處理方法同步聚1.4。72 h后使用低溫離心機(jī)以2 000 r/min離心10 min，去除細(xì)胞碎片，收集培養(yǎng)液上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測上清中VEGF的含量，每組設(shè)3個復(fù)孔。

3.4內(nèi)皮細(xì)胞小管形成實驗取96孔板，每孔中加入Matrigel基質(zhì)膠50 μL，37 ℃孵育箱中60 min使膠凝固，分別以25、50、100 mg/L褐藻糖膠作用的RPMI 8226細(xì)胞培養(yǎng)液上清與含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液等體積混合成條件培養(yǎng)基重懸EA.hy 926細(xì)胞，種入已鋪膠的96孔板中，每孔2×104個細(xì)胞，未處理組上清作為對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。37 ℃孵育箱中培養(yǎng)20 h后在顯微鏡下觀察, 隨機(jī)選擇5個視野拍照(×40)，應(yīng)用Image Pro Plus軟件計數(shù)形成的小管數(shù)目并比較小管的面積。

3.5Western blot檢測HIF-1α、VEGF、p-AKT和p-ERK1/2蛋白的水平細(xì)胞處理方式同3.2，收集細(xì)胞，500 r/min離心5 min，PBS洗滌3次；按照總蛋白提取試劑盒說明書低溫條件下裂解細(xì)胞，高速離心后吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度定量，按比例加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min后，-20 ℃保存。每組取50 μg蛋白質(zhì)樣本進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST稀釋 I 抗[HIF-1α (1∶1 000)、VEGF(1∶800)、AKT(1∶1 000)、ERK1/2(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)和p-ERK1/2(1∶1 000)]后4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min 3次，孵相對應(yīng) II 抗(1∶2 000)，室溫下孵育2 h，TBST洗膜10 min 3次，PVDF膜ECL發(fā)光檢測，對所得到的條帶用Fusion進(jìn)行分析。實驗重復(fù)3次。

4統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗結(jié)果采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析。統(tǒng)計數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數(shù)間兩兩比較時采用Turkey法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1褐藻糖膠對RPMI 8226細(xì)胞活力的影響

分別使用0、25、50、100、200和400 mg/L褐藻糖膠處理RPMI 8226細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，根據(jù)酶標(biāo)儀所測的吸光度值分析，隨著藥物濃度或者作用時間的增長，RPMI 8226細(xì)胞活力受到的抑制作用逐漸增強(qiáng)，以72 h對細(xì)胞的作用強(qiáng)度最大，并且當(dāng)濃度達(dá)到約200 mg/L后，褐藻糖膠對細(xì)胞活力的抑制作用逐漸進(jìn)入平臺期，見圖1。

Figure 1.The effect of fucoidan on growth of RPMI 8226 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs24 h.

圖1褐藻糖膠對RPMI 8226細(xì)胞的增殖抑制情況

2褐藻糖膠對RPMI 8226細(xì)胞周期及凋亡的影響

根據(jù)MTT實驗的結(jié)果，使用不同濃度的褐藻糖膠作用于RPMI 8226細(xì)胞72 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡情況。結(jié)果顯示與對照組相比，隨著褐藻糖膠濃度的升高，G1期的細(xì)胞比率增加，S期細(xì)胞比率減少(P<0.01)，見表1。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，凋亡率隨著藥物濃度的增加而逐漸上升，均較對照組明顯增加(P<0.01)，見圖2。

表1流式細(xì)胞術(shù)檢測等體積不同濃度褐藻糖膠對RPMI 8226細(xì)胞周期的影響

Table 1.The effect of fucoidan on the cell cycle of human multiple myeloma RPMI 8226 cells (Mean±SD.n=3)

Fucoidan(mg/L)G1phaseSphaseG2phase055.56±2.7431.62±2.4512.83±2.312559.53±4.0228.49±2.1411.98±2.275063.53±2.9021.36±2.55**15.10±3.9010067.62±2.63**17.32±3.04**15.06±1.8820071.02±3.53**13.99±2.26**14.99±2.63

**P<0.01vs0 mg/L group.

Figure 2.The apoptotic rate of RPMI 8226 cells increased gradually with the increasing concentration of fucoidan after treatment for 72 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 mg/L group.

圖2褐藻糖膠作用72 h對RPMI 8226細(xì)胞凋亡率的影響

3褐藻糖膠對RPMI 8226細(xì)胞自分泌VEGF的影響

收集各組RPMI 8226細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過ELISA法檢測上清中VEGF的分泌量，對吸光度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)褐藻糖膠對RPMI 8226細(xì)胞自分泌VEGF有抑制作用。與未處理組相比，處理組VEGF分泌量均有所下降，當(dāng)褐藻糖膠濃度為50 mg/L時VEGF的分泌受到明顯抑制，隨著濃度的升高，受抑制程度更加明顯，見表2。

表2ELISA法檢測等體積不同濃度褐藻糖膠處理細(xì)胞對VEGF自分泌的影響

Table 2.The effect of fucoidan on the secretion of VEGF in human multiple myeloma RPMI 8226 cells and the corresponding inhibitory rate (Mean±SD.n=3)

Ficoidan(mg/L)VEGFconcentration(ng/L)Inhibitoryrate(%)0640.85±15.43025629.50±11.841.77%50595.81±22.357.03%*100530.29±15.5817.25%**200485.39±13.9824.25%**

*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

4褐藻糖膠對RPMI 8226細(xì)胞培養(yǎng)液上清誘導(dǎo)小管形成的影響

未經(jīng)褐藻糖膠作用的RPMI 8226細(xì)胞培養(yǎng)液上清能夠誘導(dǎo)EA.hy 926細(xì)胞在Matrigel上形成小管結(jié)構(gòu)并逐漸連成網(wǎng)狀，管腔完整，數(shù)目多，面積較大。經(jīng)褐藻糖膠作用后的培養(yǎng)液上清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成小管的能力低于對照組，100 mg/L褐藻糖膠組小管形成明顯受到抑制，小管數(shù)目減少，管腔不連續(xù)，呈間斷狀，形成的小管面積較對照組明顯縮小(P<0.05)，200 mg/L褐藻糖膠組難以觀察到完整的小管(P<0.01)，見圖3。

5褐藻糖膠對RPMI 8226細(xì)胞HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，50 mg/L褐藻糖膠處理RPMI 8226細(xì)胞78 h后，HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，且2種蛋白表達(dá)受抑制程度與藥物濃度呈正相關(guān)，見圖4。

6褐藻糖膠對RPMI 8226細(xì)胞AKT和ERK1/2磷酸化水平的作用

Western blot實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，50 mg/L褐藻糖膠處理RPMI 8226細(xì)胞72 h后，p-AKT和p-ERK1/2的蛋白水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且2種蛋白表達(dá)受抑制程度與藥物濃度呈正相關(guān)，200 mg/L時差異更顯著(P<0.01)；而總AKT和ERK1/2的表達(dá)無明顯改變，見圖5。

討論

多發(fā)性骨髓瘤是多因素多階段發(fā)展的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率逐年升高，發(fā)病年齡日趨年輕化。隨著新藥(如雷那度胺、硼替佐米)的問世，多發(fā)性骨髓瘤患者的平均生存時間由原來的3年逐漸延長至6年，但是多發(fā)性骨髓瘤的臨床療效仍然不理想[1]，這使得尋找新的有效的治療方法很有必要。

Figure 3.The effect of fucoidan on the tube formation of EA.hy926 cells was examined by plating EA.hy 926 cells on the Matrigel for 6 h (×40). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖3經(jīng)過褐藻糖膠處理后的RPMI 8226細(xì)胞培養(yǎng)液上清對EA.hy 926細(xì)胞形成小管能力的影響

Figure 4.The protein expression levels of HIF-1α and VEGF in fucoidan group were significantly lower than those in control group. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖4Western blot檢測等體積不同濃度褐藻糖膠處理細(xì)胞后HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)的影響

Figure 5.The protein levels of p-AKT and p-ERK1/2 in fucoidan group were significantly lower than those in control group but not total AKT and ERK1/2. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖5Western blot檢測等體積不同濃度褐藻糖膠處理細(xì)胞后總AKT和ERK1/2蛋白表達(dá)及相應(yīng)磷酸化水平的影響

褐藻糖膠由日本學(xué)者Kylin首次從褐藻掌狀海帶中發(fā)現(xiàn)，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒及降脂等多種生物學(xué)功能，近年來被單用于多種腫瘤(如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等)的研究，并取得了一定的成果[5]。本研究褐藻糖膠作用于多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞株，結(jié)果表明，單用褐藻糖膠可以抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株的增殖，將細(xì)胞阻滯于G1期，并促進(jìn)其凋亡。

血管生成是造成多發(fā)性骨髓瘤復(fù)發(fā)、難治的重要原因，抗血管生成是治療多發(fā)性骨髓瘤等多種腫瘤的重要靶點[6-7]。VEGF是促進(jìn)血管生成最重要的炎癥因子[8]。有研究表明多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓中血管生成明顯增多，且與疾病進(jìn)展、預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[9]，本研究收集單純的骨髓瘤細(xì)胞株培養(yǎng)液上清，經(jīng)過褐藻糖膠處理的細(xì)胞培養(yǎng)液上清檢測其中VEGF的含量。結(jié)果表明，隨著藥物濃度的增高，骨髓瘤細(xì)胞自分泌的VEGF含量逐漸減少，當(dāng)褐藻糖膠濃度達(dá)到50 mg/L時，VEGF分泌量明顯減少，進(jìn)一步通過Western blot檢測骨髓瘤細(xì)胞的VEGF蛋白的表達(dá)量，其表達(dá)量同樣減低。

小管形成是目前檢測血管生成最重要的體外實驗，內(nèi)皮細(xì)胞能否在基質(zhì)膠上形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)是檢測血管生成能力最直觀的方法[10]。單純RPMI 8226細(xì)胞培養(yǎng)液上清能夠有效誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy 926于基質(zhì)膠上形成完整的小管，而經(jīng)褐藻糖膠處理的RPMI 8226細(xì)胞培養(yǎng)液上清誘導(dǎo)EA.hy 926細(xì)胞形成小管的能力減弱，200 mg/L褐藻糖膠組難以觀察到完整的小管，這進(jìn)一步說明褐藻糖膠能夠抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成。

許多生長因子、原癌基因等通過激活PI3K/AKT與MAPK/ERK1/2信號通路上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，繼而調(diào)節(jié)VEGF的水平。PI3K/AKT通路在多種腫瘤細(xì)胞中持續(xù)激活，并且與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、血管生成及耐藥關(guān)系密切[11]，目前已成為腫瘤靶向治療的研究對象。ERK1/2在多發(fā)性骨髓瘤中處于高度活化狀態(tài)[12]，同時是血管生成的重要信號分子，與其下游的信號分子調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化、增殖和遷移，促進(jìn)管腔的形成。HIF-1α是直接調(diào)控VEGF的上游因子[13]，35%的多發(fā)性骨髓瘤患者中存在 HIF-1α的過表達(dá)[14]，而HIF-1α的過表達(dá)造成多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞自分泌及骨髓微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞旁分泌過多的VEGF等血管生長因子，促進(jìn)血管生成，促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤的進(jìn)展[15]。我們檢測三者的表達(dá)量，隨著褐藻糖膠濃度的提高，AKT和ERK1/2的磷酸化水平逐漸降低，并有效減少HIF-1α的表達(dá)，這可能是褐藻糖膠減弱骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成能力的主要機(jī)制之一。

近年來，針對治療多發(fā)性骨髓瘤的新藥研究取得較大進(jìn)展，但是常規(guī)化療帶來的毒副作用及不同程度的耐藥是兩大亟待解決的重要問題，這使得低毒的生物提取物可能成為臨床治療的重要手段。本研究證實，褐藻糖膠能夠有效抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，降低骨髓瘤細(xì)胞自分泌及表達(dá)VEGF，減弱骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成小管的能力，抑制HIF-1α表達(dá)，降低AKT和ERK1/2的磷酸化，為研究褐藻糖膠治療多發(fā)性骨髓瘤的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

*[基金項目]河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(No.08966107D)；2012年保定市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃(No.12ZF105)

Effects of fucoidan on angiogenesis of human multiple myeloma RPMI 8226 cellsLIU Fen1, XIAO Qing1, TANG Wei-xue2, Lü Jing-long3

(1DepartmentofHematology，2CentralLaboratory,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingUniversityofMedicalSciences,Chongqing400016,China;3DepartmentofHematology,ChongqingThreeGorgesCentralHospital,Chongqing404000,China.E-mail: 13220327680@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of fucoidan on the angiogenesis of multiple myeloma cells in vitro, and its related mechanisms. METHODS: The human multiple myeloma RPMI 8226 cells and human endothelial cells were cultured in vitro. The growth inhibition rate of RPMI 8226 cells was examined by MTT assay. The cell cycle and apoptosis rate were measured by flow cytometry. RPMI 8226 cells were treated with fucoidan for 72 h, and the cell culture supernatant was collected. The VEGF concentration was examined by ELISA, and the tube formation assay was applied to assess the angiogenic activity. After treatment with fucoidan for 72 h at different concentrations, the protein levels of HIF-1α, VEGF, p-AKT and p-ERK1/2 were detected by Western blot. RESULTS: Fucoidan inhibited the growth of RPMI 8226 cells in a dose- and time-dependent manner. After treatment with fucoidan for 72 h, the cell cycle was arrested at G1phase, and the apoptotic rate of RPMI 8226 cells was increased with the increasing concentration of fucoidan, which was much higher than that in control group (P<0.05). The VEGF concentration was significantly decreased with the increa-sing concentration of fucoidan. The numbers and areas of the capillary-like structures decreased while the concentration of fucoidan increased, and those at 100 mg/L were less than those in the control (P<0.05). The protein levels of HIF-1α, VEGF, p-AKT and p-ERK1/2 in fucoidan group were significantly lower than those in control group (P<0.05). CONCLUSION: Fucoidan inhibits the secretion of VEGF in multiple myeloma cells, and reduces angiogenesis induced by multiple myeloma cells. It inhibits the protein expression of HIF-1α and VEGF, which may be related to inhibiting the phosphorylation of AKT and ERK1/2.

[KEY WORDS]Fucoidan; Multiple myeloma; HIF-1α； VEGF; AKT； ERK1/2

通訊作者△梁文同 Tel: 0312-2096686; E-mail: liangwentong1967@sina.com; 成志勇 Tel: 0312-2096685; E-mail: dzczy@sohu.com

[收稿日期]2015- 06- 08[修回日期] 2015- 09- 09

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2158- 06

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.007

[中圖分類號]R363; R979.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A