18α-GA通過上調蛋白酶體活性促進晚期骨髓間充質干細胞增殖*

楊佳超，　趙云鶴，　蔣　蓉，　陸　利

(山西醫科大學人體解剖學教研室，山西 太原 030001)

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18α-GA通過上調蛋白酶體活性促進晚期骨髓間充質干細胞增殖*

楊佳超，趙云鶴，蔣蓉，陸利△

(山西醫科大學人體解剖學教研室，山西 太原 030001)

[摘要]目的： 明確18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinic acid，18α-GA)對晚期骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)衰老標志物和增殖能力的影響。方法: 晚期BMSCs(≥14代)應用2.0 mg/L的18α-GA持續作用30 d，比較18α-GA組與DMSO組蛋白酶體活性；衰老相關β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)染色和Western blot檢測衰老相關蛋白p53、p21和p16的表達變化；CCK-8、BrdU摻入試驗、流式細胞術和Western blot分別檢測細胞增殖能力、細胞周期分布及細胞周期相關分子表達變化。結果: 應用18α-GA 后BMSCs蛋白酶體活性較DMSO組增高約0.2倍(P<0.01)。18α-GA組SA-β-Gal陽性衰老細胞較DMSO組減少，且細胞著色淺淡；衰老相關蛋白p53和p21表達水平分別較對照組降低(P<0.05)。CCK-8實驗及流式細胞術結果顯示18α-GA組細胞增殖能力較DMSO組增高，S期細胞顯著增多(P<0.05)，18α-GA組BrdU染色陽性細胞率較DMSO對照組增高(P<0.05)。18α-GA組細胞周期相關蛋白cyclin D1及CDK4表達水平分別較DMSO組增高(P<0.05)。結論: 18α-GA可激活晚期BMSCs蛋白酶體活性延緩細胞衰老，并且可能通過上調細胞周期相關蛋白表達水平促進晚期BMSCs增殖。

[關鍵詞]18α-甘草次酸； 蛋白酶體； 骨髓間充質干細胞； 細胞增殖

骨髓間充質干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是目前組織工程應用較廣泛的種子細胞之一，而源自體內的BMSCs數量有限，需經體外長期培養擴增后方可用于臨床移植治療。近期的研究報道表明BMSCs存在復制性衰老，進而限制了其臨床應用[1-2]。我們的前期研究結果證實蛋白酶體活性降低是BMSCs復制性衰老的重要因素[3]，增強蛋白酶體活性有助于維持BMSCs細胞活力，延緩其衰老進程[4]。18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinicacid，18α-GA)是一種源自甘草的三萜類抗氧化劑[5-8]。近期研究結果提示，18α-GA能夠促進蛋白酶體亞單位的組裝與合成，提高成纖維細胞的細胞活力[9]。為此，本研究擬觀察18α-GA對晚期BMSCs的影響，探討維持BMSCs細胞活力的有效途徑，以期為臨床應用提供數量充足的優質種子細胞。

材料和方法

1BMSCs的體外培養和18α-GA干預實驗

BMSCs購自ScienCellResearchLaboratory，用含10%胎牛血清 (HyClone) 的DMEM(Gibco)培養基(內含2mmol/LL-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)培養，待細胞生長至90% 融合時進行傳代。依據體外傳代次數將BMSCs分為早期組(≤4)和晚期組(≥14次)。晚期BMSCs分為18α-GA實驗組(2.0 mg/L的18α-GA持續作用30 d)和DMSO 溶劑對照組(等體積含DMSO的溶劑持續作用30 d)。

2實驗方法

2.1蛋白酶體活性檢測實驗收集BMSCs，用Lysisbuffer提取蛋白質，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，依照蛋白酶體活性分析試劑盒(Millipore)說明書進行操作，熒光酶標儀激發光380nm,發射光460nm處檢測分析。

2.2衰老相關β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-Gal)染色檢測衰老細胞將18α-GA干預完畢的BMSCs消化并調整至1×107/L，傳代種于包被好的24孔板內，加新鮮培養基至1 mL，孵箱培養過夜使其貼壁，每組設3個復孔；次日，吸除舊培養基，用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗1～2次，每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶固定液，室溫固定15 min；吸除固定液，用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗3次，于搖床上輕搖；吸除PBS，每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色工作液；于濕盒內37 ℃避光孵育15～18 h；即刻于顯微鏡下觀察、拍照。

2.3CCK-8實驗和BrdU實驗檢測細胞增殖能力及細胞活力將細胞按照每孔2 000個接種于96孔板，每孔加入10 μL CCK8溶液，培養孵育4 h，酶標儀450 nm處測定吸光度。

將MG132和DMSO干預處理后的細胞按照1×107/L接種于蓋玻片上，用含有10μmol/LBrdU的培養基作用72h，隨后進行BrdU/DAPI免疫熒光雙標，熒光顯微鏡(Olympus-BX51)觀察，計數。

2.4Westernblot實驗檢測衰老相關蛋白及細胞周期相關蛋白表達水平收集BMSCs細胞，提取蛋白質，BCA法測定蛋白濃度。取20μg總蛋白上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉印于PVDF膜，5%脫脂奶粉液封閉后加入I抗[p53(1∶1 000)、p21(1∶1 000)、p16(1∶1 000)、兔抗cyclinD1(1∶1 000)、兔抗CDK4(1∶1 000)和兔抗β-actin(1∶2 000)]4 ℃ 孵育過夜，以上抗體購自康為世紀生物科技有限公司。辣根過氧化物酶偶聯抗兔II抗(1∶5 000)室溫雜交2h，按照化學發光檢測試劑盒(GEHealthcareLifeScience)說明書曝光顯影于膠片。

2.5流式細胞術檢測細胞周期分布和細胞增殖指數收集BMSCs細胞，PBS清洗2次，棄上清，輕彈管壁分散細胞團，70% 冷乙醇4 ℃固定4h，1 000r/min室溫離心5min棄上清，PBS重懸細胞團，300 目網過濾，加入50mg/L碘化丙啶(PI)染液(50mg/LPI，10mg/LRNase，1‰TritonX-100)，室溫避光20min后流式細胞儀檢測G0/G1、S和G2/M各期細胞分布。

3統計學處理

采用SPSS16.0 軟件進行統計分析，數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，多組間的比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，SNK-q檢驗進行兩兩比較，兩組間比較采用t 檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

118α-GA對晚期BMSCs20S蛋白酶體活性的影響

18α-GA組20S蛋白酶體活性較DMSO對照組顯著上升約0.2倍(P<0.01)，提示應用18α-GA可上調體外擴增培養晚期BMSCs20S蛋白酶體活性，見圖1。

Figure1.Theeffectof18α-GAon20Sproteasomeactivityinlate-passageBMSCs.Mean±SEM. n=3.**P<0.01 vsDMSOgroup.

圖118α-GA對晚期BMSCs20S蛋白酶體活性的影響

218α-GA對晚期BMSCs衰老相關標志的影響

18α-GA組SA-β-Gal陽性細胞數量較少且著色淺淡，見圖2A。Westernblot結果表明給予18α-GA后晚期BMSCs衰老相關蛋白p53和p21表達水平均較DMSO組下降(P<0.05)，但p16表達水平無顯著變化，見圖2B。結果提示應用18α-GA有助于延緩BMSCs衰老進程。

318α-GA對晚期BMSCs增殖能力的影響

CCK-8檢測結果表明，晚期BMSCs細胞增殖能力較早期細胞顯著下降(P<0.05)；但應用18α-GA后，BMSCs細胞增殖能力較DMSO對照組增高0.3倍(P<0.01)，見圖3A。BrdU染色結果顯示18α-GA組細胞BrdU染色陽性率較DMSO對照組增高(P<0.05)，見圖3B。 流式細胞術結果也證明，18α-GA組S期細胞為顯著高于DMSO對照組(P<0.05),見圖3C及表1。

418α-GA對晚期BMSCs細胞周期相關蛋白表達水平的影響

Westernblot免疫印跡結果證實，18α-GA組細胞周期依賴性蛋白cyclinD1的表達水平顯著增加，為DMSO對照組的2.8倍(P<0.01)，其激酶CDK4的表達水平是DMSO對照組的1.4倍(P<0.05)，見圖4。結果提示應用18α-GA能夠增強晚期BMSCs細胞周期相關蛋白cyclinD1和CDK4的表達水平。

討論

18α-GA是源于甘草酸的三萜皂苷類化合物，甘草酸是常用中藥甘草中最主要的活性成分之一，在胃腸道微生物中β-葡萄糖醛酸酶作用下水解成甘草次酸后被吸收，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保肝解毒、增強免疫功能等作用[5-8]。NargesB等[7]研究發現，18α-GA通過促進樹突狀細胞的成熟和調節Th1/Th2免疫應答，對抗宿主體內發生的傳染病，發揮免疫調節作用。此外，還有研究證明18α-GA能夠促進人乳腺癌細胞凋亡作用，抑制腫瘤細胞生長[8]。近期研究報道證明，將18α-GA作用于晚期人成纖維細胞，可以激活核因子E2相關因子2(nuclearfactorE2-relatedfactor2，Nrf2)，促使蛋白酶體亞單位β1、β2和β5轉錄激活，增加蛋白酶體的組裝與合成，提高蛋白酶體功能活性，抵抗氧化應激，延緩晚期人成纖維細胞復制性衰老進程[9]。課題組前期研究證實，蛋白酶體活性下調是導致晚期BMSCs出現復制性衰老的重要因素，本研究顯示應用18α-GA干預晚期BMSCs，能夠使BMSCs蛋白酶體活性較DMSO對照組上升約0.2倍，SA-β-Gal染色衰老陽性細胞數量減少且著色較淺，提示18α-GA可以增強晚期 BMSCs蛋白酶體功能活性，延緩BMSCs復制性衰老進程。同時Chondrogianni等[10]和Arslan等[11]應用WI38成纖維細胞作為衰老細胞模型，觀察蛋白酶體亞單位PSMB5過表達對細胞衰老的影響，研究結果發現提高蛋白酶體活性可增強細胞活力，延緩細胞衰老進程，與本課題組的研究結果相一致。相反，趙云鶴等[12]應用蛋白酶體可逆性抑制劑MG132抑制小鼠腦室室管膜下區蛋白酶體活性后，神經干細胞的增殖能力顯著下降，進一步表明蛋白酶體活性與細胞活力密切相關。

Figure2.Delayedsenescenceprocessoflate-passageBMSCsaftertreatmentwith18α-GA.A：SA-β-Galstaining；B：Westernblotanalysisforp53,p21andp16expression.Mean±SEM. n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group.

圖218α-GA對晚期BMSCs衰老相關標志的影響

Figure3.Theeffectof18α-GAoncellproliferationinBMSCs.A：CCK-8assay;B:BrdUincorporationassay;C:flowcytometry.Mean±SEM. n=6.#P<0.05vsearly group；*P<0.05,**P<0.01 vsDMSOgroup.

圖318α-GA對BMSCs增殖能力的影響

表1流式細胞術檢測BMSCs細胞周期分布

Table1.ThecellcycledistributionofBMSCsmeasuredbyflowcytometry(%.Mean±SEM. n=6)

GroupG0/G1phaseSphaseG2/MphaseEarly83.91±3.7514.64±1.942.94±0.32DMSO93.12±0.79**3.54±1.01**3.67±0.0718α-GA90.97±0.04**7.01±0.65**#2.03±1.01

**P<0.01vsearly group；#P<0.05vsDMSO group.

Figure 4.The expression of cyclin D1 and CDK4 in late-passage BMSCs after treatment with 18α-GA. Mean±SEM.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group.

圖418α-GA對晚期BMSCs 的cyclin D1和CDK4表達水平的影響

已有研究報道隨傳代次數增加，晚期細胞p53、p21、p16等衰老相關蛋白表達水平上升，細胞自我更新和增殖能力喪失[1, 13-15]。Kim等[15]研究發現，在纖維軟骨髓核細胞的衰老過程中，p53表達上調，而p53活性增高可促進p21的表達從而激活pRB，進而引起細胞衰老。Christian等[16]應用人類晚期B-J包皮成纖維細胞慢病毒轉染GSE-22使p53失去活性后，細胞中DNA的合成以及細胞增殖上調90%左右，細胞群體倍增次數增高，證明p53失活可以逆轉細胞復制性衰老。課題組研究發現應用18α-GA 干預晚期BMSCs提高蛋白酶體活性后，衰老相關蛋白p53和p21表達水平下降，細胞周期相關蛋白cyclin D1和CDK4的表達增高，CCK8、BrdU染色和流式細胞儀的檢測結果也顯示細胞增殖能力提高，S期細胞明顯增多，提示18α-GA可通過抑制晚期BMSCs 細胞p53和p21表達活性，激活細胞周期相關蛋白cyclin D1和CDK4的表達，促進晚期BMSCs越過G1/S細胞周期轉換點，恢復晚期BMSCs細胞增殖能力，改善細胞生長速度，延緩細胞衰老進程。

由此可見，18α-GA作用于晚期BMSCs，可以上調蛋白酶體活性進而延緩BMSCs的復制性衰老進程，恢復細胞活力。本研究采用化合物改善BMSCs蛋白酶體活性，此方法較基因修飾等手段更安全，并且操作簡便，易于推廣，為干細胞的臨床應用提供實驗依據。

[參考文獻]

[1]Tonoki A, Kuranaga E, Tomioka T, et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process[J]. Mol Cell Biol, 2009， 29(4):1095-1106.

[2]Yew TL, Chiu FY, Tsai CC, et al. Knockdown of p21Cip1/Waf1enhances proliferation, the expression of stemness markers, and osteogenic potential in human mesenchymal stem cells[J]. Aging Cell, 2011, 10(2):349-361.

[3]Lu L, Song HF, Zhang WG, et al. Potential role of 20S proteasome in maintaining stem cell integrity of human bone marrow stromal cells in prolonged culture expansion [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 422(1):121-127.

[4]Lu L, Song HF, Wei JL, et al. Ameliorating replicative senescence of human bone marrow stromal cells by PSMB5 overexpression[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 443(4):1182-1188.

[5]Davidson JS, Baumgarten IM. Glycyrrhetinic acid derivatives: a novel class of inhibitors of gap-junctional intercellular communication[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1988, 246(3):1104-1107.

[6]Contreras JE, Sánchez HA, Eugenin EA, et al. Metabolic inhibition induces opening of unapposed connexin 43 gap junction hemichannels and reduces gap junctional communication in cortical astrocytes in culture[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(1):495-500.

[7]Narges B, Mohammad HK, Zahra A. Phenotypic and functional maturation of murine dendritic cells induced by 18 alpha- and beta-glycyrrhetinic acid[J]. Immunopharmacol Immunotoxicol, 2014, 36(1):52-60.

[8]Rossi T, Castelli M, Zandomeneghi G, et al. Selectivity of action of glycyrrhizin derivatives on the growth of MCF-7 and HEP-2 cells[J]. Anticancer Res, 2003, 23(5A):3813-3818.

[9]Kapeta S, Chondrogianni N, Gonos ES. Nuclear erythroid factor 2-mediated proteasome activation delays senescence in human fibroblasts[J]. J Biol Chem, 2010, 285(11):8171-8184.

[10]Chondrogianni N, Stratford FL, Trougakos IP, et al. Central role of the proteasome in senescence and survival of human fibroblasts: induction of a senescence-like phenotype upon its inhibition and resistance to stress upon its activation[J]. J Biol Chem, 2003, 278(30):28026-28037.

[11]Arslan MA, Chikina M, Csermely P, et al. Misfolded proteins inhibit proliferation and promote stress-induced death in SV40-transformed mammalian cells[J]. FASEB J, 2012, 26(2):766-777.

[12]趙云鶴, 張衛國, 朱茜, 等. 蛋白酶體抑制劑MG132對腦室室管膜下區神經干細胞增殖潛能的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(9):1704-1707.

[13]Banfi A, Muraglia A, Dozin B, et al. Proliferation kine-tics and differentiation potential ofexvivoexpanded human bone marrow stromal cells: implications for their use in cell therapy[J]. Exp Hematol, 2000, 28(6):707-715.

[14]Mareschi K, Ferrero I, Rustichelli D, et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow[J]. J Cell Biochem, 2006, 97(4): 744-754.

[15]Kim KW， Ha KY， Lee JS, et al. Senescence of nucleus pulposus chondrocytes in human intervertebral discs[J]. Asian Spine J, 2008, 2(1):1-8.

[16]Beauséjour CM, Krtolica A, Galimi F, et al. Reversal of human cellular senescence: roles of the p53 and p16 pathways[J]. EMBO J, 2003, 22(16): 4212-4222.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

*[基金項目]廣東省醫學科研基金立項課題(No. B2012195)；國家中醫藥管理局三級實驗室病理生理實驗室開放基金資助項目(No. 2011ZD004)

Upregulationofproteasomeactivityby18α-GApromotesproliferationoflate-passageBMSCsin vitroYANGJia-chao,ZHAOYun-he,JIANGRong,LULi

(Department of Anatomy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China. E-mail: luli7300@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of 18 alpha-glycyrrhetinic acid (18α-GA) on delaying the senescent progress and promoting the proliferation in late-passage bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). METHODS: Late-passage BMSCs were incubated with 2.0 mg /L 18α-GA or the same volume of DMSO for 30 d, and the cells were harvested to determine the proteasome activity. The expression of senescence-related proteins p53, p21 and p16 was detected by senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) staining and Western blot. The cell proliferation, the expression level of cell cycle-related proteins and cell cycle distribution of the cells were measured by CCK-8 assay, BrdU incorporation, Western blot and flow cytometry. RESULTS: Compared with DMSO group, the proteasome activity in 18α-GA group increased significantly by about 0.2 times (P<0.01). SA-β-Gal-positive cells in 18α-GA group decreased, and cell staining was lighter. The contents of p53 and p21 in 18α-GA group were decreased (P<0.05). The results of CCK-8 assay showed that the A value in 18α-GA group was 0.3 times higher than that in DMSO group (P<0.01). BrdU incorporation showed the increased proliferation in 18α-GA group compared with DMSO group (P<0.05). The cells in G1phase in 18α-GA group decreased significantly compared with DMSO group, while the cells in S phase increased significantly (P<0.05). The expression level of cyclin D1 in 18α-GA group was 2.8 times higher than that in DMSO group (P<0.01), and the CDK4 level was 1.4 times higher than that in DMSO group (P<0.05). CONCLUSION: Activation of the proteasome activity by 18α-GA delays the aging process in the BMSCs and promotes the cell proliferation via up-regulation of the cell cycle-related proteins.

[KEY WORDS]18α-Glycyrrhetinic acid; Proteasome; Bone marrow mesenchymal stem cells; Cell proliferation

通訊作者△Tel: 020-38688909; E-mail: tzhuker@jnu.edu.cn

[收稿日期]2015- 09- 06[修回日期] 2015- 10- 30

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2188- 07

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.012

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A