小白菊內酯對球囊損傷后新生內膜增殖的影響

毛　霞,　高麗華,　鄧昌明

(重慶醫科大學附屬第二醫院心血管內科，重慶 400010)

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小白菊內酯對球囊損傷后新生內膜增殖的影響

毛霞,高麗華,鄧昌明△

(重慶醫科大學附屬第二醫院心血管內科，重慶 400010)

[摘要]目的： 研究小白菊內酯(PN)對球囊損傷(balloon injury,BI)后新生內膜的影響及機制。方法: 將30只雄性新西蘭兔2.0～2.3 kg在高脂適應性喂養1周后隨機分為6組：假手術+生理鹽水(sham+NS)組; 假手術+二甲基亞砜(sham+DMSO)組；球囊損傷+生理鹽水(BI+NS)組；球囊損傷+DMSO(BI+DMSO)組；球囊損傷+PN低劑量(BI+PN low)組；球囊損傷+PN高劑量(BI+PN high)組。PN溶解于DMSO，術后立即按分組腹腔注射同體積藥物治療，每日1次。繼續高脂喂養4周后取血清及髂總動脈，分析比較血管內-中膜厚度、半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶(caspase)-1、白細胞介素(IL)-1β和IL-8的表達量以及血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的含量。 結果: BI+DMSO組較sham+DMSO組內膜厚度、caspase-1、IL-1β和 IL-8的表達量增加(P<0.05)；與BI+DMSO組比較，上述指標在PN高、低劑量組有不同程度降低，但僅PN高劑量組與其差異有統計學意義(P<0.05)；各組血脂指標差異不明顯。結論: PN能抑制球囊損傷后的內膜增殖，其機制可能與抗炎作用有關。

[關鍵詞]小白菊內酯； 內膜增殖； Caspase-1

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作為心腦血管疾病的重要的病因[1]，嚴重影響人類的健康。AS是一種內皮損傷后血管增殖性疾病，以血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型改變、遷移以及過度增殖為特征，因此抑制VSMCs的異常增殖成為防治AS的措施之一[2]。炎癥貫穿于AS發生發展的全過程[3]，內膜損傷后多種炎癥細胞侵潤并分泌大量促炎因子，導致VSMCs增殖并向內膜遷移，血管內膜增厚，管腔狹窄，研究表明抑制炎癥可達到改善內膜增殖的目的[4]。小白菊內酯(parthenolide，PN)是提取于墨西哥印度草藥的一種倍半萜烯內酯，廣泛用于抗腫瘤研究，近年來PN因其抗炎作用而受到關注。本實驗通過高脂喂養聯合球囊損傷(balloon injury,BI)建立模型，觀察PN對兔髂動脈損傷后內膜增殖的影響并探討其機制，為臨床防治AS提供新思路。

材料和方法

1材料和儀器

30只雄性新西蘭白兔，體重2.0～2.3 kg，由重慶醫科大學試驗動物中心提供，許可證號為SCXK(渝)2012-0001。

2主要材料和儀器

PN(天津士蘭生物科技公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于Sigma；免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物科技公司)；Western blot配膠試劑盒、ECL發光液及總蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物科技公司)；膽固醇及蛋白濃度測定試劑盒(北京鼎國昌盛生物科技公司)；Caspase-1 p20抗體、IL-1β抗體(北京博奧森生物科技公司)；β-actin抗體(北京康為世紀生物科技公司)；IL-8 ELISA試劑盒(北京欣博盛生物科技公司)；3.0 Fogarty球囊導管(Edwards Life Science)；AUI1000自動生化分析儀(Olympus)。

3主要方法

3.1模型構建在既往建?；A上進行改良[5-6]，將30只家兔用高脂(1%膽固醇+6%豬油+93%基礎飼料)適應性喂養1周后隨機分為6組，每組5只：假手術+生理鹽水(sham+NS)組; 假手術+二甲基亞砜(sham+DMSO)組；球囊損傷+生理鹽水(BI+NS)組；BI+DMSO組；BI+PN低劑量(BI+PN low)組,PN劑量為1 mg/kg；BI+PN高劑量(BI+PN high)組，PN劑量為2 mg/kg。用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg耳緣靜脈注射進行麻醉，右側腹股溝區備皮，鈍性分離血管鞘，暴露股動脈，送入球囊導管至髂總動脈，以0.69 ATM的壓力充盈球囊并回拉導管損傷內膜，重復3次，每次間歇約1 min，抽空球囊后退出血管，結扎股動脈，逐層縫合皮膚。對照組只分離結扎股動脈，不行球囊損傷。術后給予兔子耳緣靜脈注射普通肝素100 U/kg抗凝，肌肉注射青霉素8×105U/d，連續3 d預防感染。術后立即按照分組腹腔注射給藥(PN溶解于4% DMSO)，每天1次，共4周。

3.2標本采集繼續高脂喂養4周后，取出標本。家兔麻醉后固定，鈍性分離血管鞘，股靜脈采血，然后空氣栓塞處死，取出建模后髂血管(約4 cm)，生理鹽水沖洗，分成2段，1段立即放入-80 ℃冰箱儲存，另1段用4%多聚甲醛固定。采集血液靜置1.5 h后3 000 r/min離心15 min，取出血清置-80 ℃儲存備用。

3.3HE及免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)法染色固定后的髂血管行石蠟包埋切片(4 μm)，HE染色用于觀察髂血管的組織學特點并測量血管內-中膜厚度。根據試劑盒說明書對caspase-1(1∶100)和IL-1β(1∶100)進行IHC染色，細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性細胞。用Image Pro Plus 6.0軟件測量血管內-中膜厚度以及各組caspase-1、IL-1β的表達(取5個400倍視野陽性細胞數的平均值作為上述指標的相對表達量)。

3.4Western blot檢測caspase-1和IL-1β的水平提取各組髂血管標本中總蛋白后，上樣80 μg蛋白量用于電泳和膜轉移，PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，Ⅰ抗caspase-1 p20 (1∶200)、IL-1β (1∶200) 和β-actin(1∶200) 孵育4 ℃過夜。次日山羊抗兔多抗(1∶500)37 ℃孵育1 h，ECL發光液暗室曝光。以β-actin作為內參照，Quantity One 軟件采集分析結果，以目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值作為其相對表達量。

3.5ELISA檢測IL-8的含量取血清約200 μL，根據兔IL-8試劑盒說明書進行檢測。

3.6血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)和高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)測定取血清500 μL置于Olympus AUI1000自動生化分析儀檢測各組血脂水平。

4統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行數據統計分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示。多組之間的比較采用單因素方差分析，各組均數之間兩兩比較采用SNK-q檢驗，若方差不齊則采用Dunnett’s T3檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1家兔存活情況及PN對新生內膜增殖影響

建模后30只新西蘭兔均存活并最終納入實驗。在前期的準備工作中，為了排除溶劑DMSO的影響，分別設置了相關溶劑對照組，結果顯示本實驗中所采用的4% DMSO對內-中膜厚度無明顯影響。HE結果顯示sham+NS及sham+DMSO組無內膜增殖，內膜光滑連續，中膜平滑肌細胞排列整齊；而BI+NS及BI+DMSO組內膜增殖明顯，中膜平滑肌細胞排列紊亂；PN低、高劑量組內膜增殖有不同程度改善，但僅PN高劑量組與BI+DMSO組差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、2。

Figure 1.The HE staining for the effect of PN on neointimal hyperplasia (×400).

圖1PN對內-中膜增殖的作用

Figure 2.The intima-medium thickness in different groups. Mean±SD.n=5.#P<0.05vsBI+DMSO.

圖2各組內-中膜厚度比較

2IHC結果

Sham+DMSO組中的caspase-1和IL-1β水平較低,BI+DMSO組與其比較， caspase-1和IL-1β的水平明顯增高(P<0.05)；caspase-1和IL-1β的水平在PN高劑量組中顯著下降(P<0.05)，見圖3、4。

Figure 3.The expression of caspase-1 and IL-β in different groups(IHC，×400).

圖3免疫組織化學分析caspase-1 及IL-β的表達

Figure 4.The number of positive cells in different groups. Mean±SD.n=5.#P<0.05vsBI+DMSO.

圖4各組caspase-1 及IL-β的陽性細胞數比較

3Western blot結果

與sham+DMSO組比較，BI+DMSO組中的caspase-1/pro-caspase-1和IL-1β/pro-IL-1β的比值明顯升高(P<0.05)；PN高劑量組中caspase-1/pro-caspase-1和IL-1β/pro-IL-1β的比值較BI+DMSO組顯著減少(P<0.05)，見圖5。

4血清IL-8含量

血清IL-8于球囊損傷后含量為(40.51±4.42)ng/L,較sham+DMSO組[(25.18±3.27)ng/L]明顯增加；而給予高劑量PN后，血清IL-8含量降至(29.45±1.33) ng/L(P<0.05)，低劑量PN組減少不明顯。

Figure 5.The level of caspase-1/pro-caspase-1, IL-1β/pro-IL-1β in different groups. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsBI+DMSO.

圖5各組caspase-1和IL-1β的蛋白表達

5血脂TC、TG、LDL和HDL含量

各組血脂指標含量組間差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

討論

炎癥在AS的發生發展中起著重要作用。VSMCs是動脈血管壁的主要成分之一，其增殖和遷移被認為是AS等血管增殖性疾病的重要原因。在炎癥作用下，VSMCs可向內膜下遷移，并在此過程中分裂增殖形成新生內膜[7]。Duewell等[8]研究表明通過NOD樣受體家族蛋白(NOD-like receptor protein，NLRP)-3炎性小體途徑可促進AS病變形成，caspase-1是NLRP3炎性小體的重要組成部分[9]，同時NLRP3炎性小體是caspase-1活化的分子平臺，活化后的caspase-1能促進pro-IL-1β轉化為具有活性的IL-1β[10]。IL-1β是一種重要的炎癥細胞因子，研究表明它通過多個環節參與AS發生發展：(1)通過上調黏附因子、趨化蛋白合成以及破壞凝血-抗凝平衡，導致血管內凝血，減緩血流，促進炎性細胞黏附于血管壁[11]；(2)誘導血小板衍化生長因子和血漿溶酶原激活物抑制劑-1的合成和釋放，進而刺激VSMCs的有絲分裂增殖，內皮細胞再生和細胞外基質的沉著，促進新生內膜形成；(3)上調氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)及其受體的表達，ox-LDL可介導內皮細胞損傷和凋亡，并促進VSMCs的增生;(4)通過激活NF-κB信號通路，誘導IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子產生，擴大炎癥反應級聯。其中IL-8是一種強有力的促血管生成因子，能促進內皮細胞和VSMCs的增殖和遷移;(5)誘導VSMC和巨噬細胞吞噬大量的LDL并轉化成為泡沫細胞[12];(6)促進金屬基質蛋白的表達，使AS斑塊不穩定甚至破裂。本實驗對NLRP3炎性小體通路的研究主要集中于caspase-1，因為它是生成具生物活性IL-1β的關鍵酶，此外，阻斷caspase-1的激活是抑制炎性小體形成的新型抗炎策略[13]。本實驗通過高脂喂養聯合球囊損傷建立模型，結果顯示血管內膜增殖明顯，caspase-1、IL-1β和IL-8表達顯著增加，推測內膜損傷后促進pro-caspase-1的募集及轉化為活性caspase-1增加，并上調下游促炎因子，加重炎癥反應，從而促進內膜增殖。

表1　各組血脂水平比較

PN分子式為C15H20O3，屬于艾葉菊屬的提取物，具有抗腫瘤、抗血小板聚集等特性。近年研究表明PN通過烷基化caspase-1的半胱氨酸殘基來抑制其表達，從而發揮抗炎作用[14]。本實驗結果顯示，給予PN 2 mg·kg-1·d-1治療后，內膜增殖受到抑制，同時血管局部活性caspase-1表達顯著下降，下游IL-1β和IL-8含量減少，與既往研究結果一致[15]，表明PN可以通過下調caspase-1起到減輕炎癥反應，進而抑制內膜增殖。

脂質代謝異常也能通過刺激炎癥反應加速AS的發生和發展[16]，本實驗通過檢測血清中TC、TG、LDL和HDL水平以研究PN與脂質代謝的關系，結果顯示各組血脂無明顯差異，說明PN對內膜的影響與降脂作用無關。

綜上所述，PN可以通過抑制caspase-1及下游炎癥介質的表達從而減少炎癥反應，減少球囊損傷后的內膜增殖。然而對于NLRP3炎性小體通路作用的研究尚處于起步階段，更明確的機制尚未闡明，因此關于PN抑制新生內膜增殖的機制也有待更進一步的研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81171178)； 山西省自然科學基金資助項目(No. 2012011036-3)； 山西省歸國人員科研基金資助項目(No. 2013011054-2)

Effect of parthenolide on neointimal hyperplasia after balloon injuryMAO Xia, GAO Li-hua, DENG Chang-ming

(DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China.E-mail:dy070308@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To detect the effect and underlying mechanism of parthenolide (PN) on neointimal hyperplasia. METHODS: After 1 week of high-fat feeding, 30 male New Zealand white rabbits (2.0～2.3 kg) were randomly divided into 6 groups: sham+NS, rabbits received 0.9% normal saline after sham operation; sham+DMSO, rabbits received DMSO after sham operation; balloon injury(BI)+NS, rabbits received NS after balloon injury; BI+DMSO, rabbits received DMSO after balloon injury; BI+PN low, rabbits received PN at 1 mg/kg after balloon injury; BI+PN high, rabbits received PN at 2 mg/kg after balloon injury. The drugs were intraperitoneal injected once a day after the operation until sacrifice. After fed with high-fat diet for 4 weeks, the intima-media thickness, the expression of caspase-1, IL-1β, the levels of IL-8, TC, TG, LDL and HDL in the serum were measured. RESULTS: Compared with sham+DMSO group, the thickness of intima, the amount of caspase-1, IL-1β and IL-8 in BI+DMSO group were significantly increased (P<0.05). The levels of caspase-1, IL-1β and IL-8 were significantly decreased in BI+PN high group compared with BI+DMSO group (P<0.05). CONCLUSION: Neointimal hyperplasia is suppressed by PN after balloon injury, the potential mechanism may be associated with its anti-inflammatory role.

[KEY WORDS]Parthenolide; Intimal hyperplasia; Caspase-1

通訊作者△Tel: 0351-4135067； E-mail： xqli2013@126.com

[收稿日期]2015- 05- 28[修回日期] 2015- 09- 29

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2221- 07

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.017

[中圖分類號]R541.4; R363.2

[文獻標志碼]A