血清型A肉毒桿菌神經毒素重鏈對Neuro-2a細胞的促神經突起再生作用*

高美玲，　王　紅，　張彩云，　蘭　婧，　李夏青△

(1山西醫科大學病理生理教研室，山西 太原 030001； 2蘭州大學第一醫院，甘肅 蘭州 730000)

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血清型A肉毒桿菌神經毒素重鏈對Neuro-2a細胞的促神經突起再生作用*

高美玲1，王紅1，張彩云2，蘭婧1，李夏青1△

(1山西醫科大學病理生理教研室，山西 太原 030001；2蘭州大學第一醫院，甘肅 蘭州 730000)

[摘要]目的： 觀察血清型A肉毒桿菌神經毒素重鏈(botulinum neurotoxin serotype A heavy chain，BoNT/A HC)對Neuro-2a細胞的促神經突起再生作用并探討與其相關的細胞內信號機制。方法: 采用體外細胞培養技術，在培養液中加入不同濃度的BoNT/A HC(0.01 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L和10 nmol/L)進行干預，于24 h、48 h和72 h時收集細胞進行免疫熒光染色，再計算細胞突起長度及有突起細胞的百分比；在此基礎上，選擇最有效的BoNT/A HC濃度作為處理劑量加入細胞培養液，于BoNT/A HC作用后不同時點收集全細胞蛋白，采用Western blot檢測p-ERK1/2及p-Akt的蛋白水平。 結果: 當BoNT/A HC 濃度為0.1 nmol/L、1 nmol/L和10 nmol/L時，細胞突起的長度及有突起細胞的百分比與對照組相比皆明顯增加，差異顯著(P<0.05)，其中1 nmol/L效果最顯著。在細胞培養液內加入1 nmol/L BoNT/A HC 后，p-ERK1/2的蛋白水平呈增加趨勢，其中BoNT/A HC作用60 min后，p-ERK1/2的增加與對照組相比差異顯著(P<0.05)；與p-ERK1/2變化趨勢類似，細胞培養液內加入1 nmol/L的BoNT/A HC后， p-Akt的蛋白水平也呈增加趨勢，其中BoNT/A HC作用15 min和60 min 時，p-Akt增加顯著(P<0.05)。結論: 一定劑量的BoNT/A HC可以促進神經細胞突起再生和生長； BoNT/A HC對Neuro-2a細胞的促神經突起再生作用機制可能通過激活與神經再生相關的信號蛋白ERK1/2和Akt的磷酸化而實現。

[關鍵詞]血清型A肉毒桿菌神經毒素重鏈； Neuro-2a細胞株； 神經突起再生； 細胞外信號調節激酶； 蛋白激酶B

肉毒桿菌神經毒素(botulinum neurotoxin，BoNT)是一種由肉毒桿菌產生并釋放的細菌外毒素，是一種致病力極強的神經肌肉毒素，可導致致命肉毒癥。BoNT也是迄今為止所發現的致死率極強的生物毒素之一[1]。目前BoNT已經廣泛用于臨床治療與肌肉反應性過強相關的一些疾病，如斜視、眨眼癥、斜頸、面肌痙攣及腦癱引起的外周肌肉強直等[2]。根據血清型將BoNT分為A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型7種類型，其中A型BoNT(BoNT/A)毒力最強，也是目前主要的市售BoNT[3]。BoNT/A為蛋白多肽，其分子由一條包含結合域的重鏈(heavy chain，HC)和一條包含酶域的輕鏈(light chain，LC)所組成，二者借二硫鍵相互連接[4]。HC有氨基端和羧基端兩個功能區域，氨基端稱為穿膜域，主要形成離子通道；羧基端稱為結合域，主要介導毒素的內吞。LC具有鋅金屬蛋白酶活性，是毒素的催化單位[5]。

關于BoNT/A 在中毒的神經末梢可以誘導軸突出芽的現象早已有一些研究報道[6]。近些年發現，BoNT/A除了抑制乙酰膽堿等神經遞質釋放外，在體外還可以直接刺激運動神經元突起增長、分枝增多[6]。基于BoNT/A LC的主要作用是裂解突觸相關蛋白，是BoNT引起中毒的主要活性單位，而BoNT/A HC為BoNT的主要膜結合蛋白，當其與宿主膜蛋白結合后不僅介導輕鏈入胞，同時還有可能通過受體-配體結合而激活細胞內多種信號通路，因此提出設想：BoNT/A HC與宿主細胞膜受體結合所引發的細胞內信號通路有可能與毒素所引發的神經末梢出芽、運動神經元突起生長及分枝增多現象有關。因此本研究采用小鼠腦神經母細胞瘤Neuro-2a細胞驗證BoNT/A HC對神經細胞的促神經突起增生作用，并探討其作用機制。

材料和方法

1細胞系及主要試劑

Neuro-2a細胞購自中國科學院細胞庫；DMEM高糖培養基(HyClone)；胎牛血清(ExCell Bio)；青鏈霉素(索來寶)；多聚賴氨酸(Sigma)；0.25%胰蛋白酶含0.02% EDTA和酚紅(全式金)；人工重組BoNT/A HC(List Biological Labotories Inc.)

2細胞培養

Neuro-2a細胞用DMEM 高糖培養液(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱(Thermo)中培養。每隔2 d 按50%換液1次，并在倒置光學顯微鏡下連續觀察細胞生長情況，當細胞密度達到培養瓶80%時進行傳代。

3方法

3.1細胞接種及處理取10代以內細胞以每孔1×104接種到預先用多聚賴氨酸鋪被的96孔培養板中，每孔50 μL培養液。并輕搖培養板使細胞均勻分布，然后放置在37 ℃、5% CO2培養箱中維持4 h，使細胞充分貼壁后加入BoNT/A HC干預，濃度分別為0 nmol/L、0.01 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L及10 nmol/L。

3.2免疫熒光法分別加入BoNT/A HC于培養液24 h、48 h和72 h后按下列方法收集細胞進行β-tubulin免疫熒光染色。棄掉培養液，用0.1 mol/L、pH 7.4的PBS洗去殘存的培養液，用4%多聚甲醛固定30 min，0.1 mol/L 的PBS洗滌(5 min×3次)，10%正常血清封閉30 min，加入鼠抗β-tubulin單克隆抗體(1∶1 000；Invitrogen)，4 ℃冰箱孵育過夜。棄去 I 抗，PBS充分沖洗(5 min×3次)，加入Alexa Fluor? 594結合的羊抗鼠IgG II 抗(1∶500； Invitrogen)，室溫避光孵育1 h，PBS充分沖洗后加入含有DAPI熒光封片劑(Invitrogen)，置于倒置熒光顯微鏡(Olympus)下進行觀察并采集圖片。

3.3神經突起長度及有突起細胞的百分比的測量應用ImageJ軟件對所攝取的β-tubulin免疫熒光染色圖片上的細胞進行突起長度測定及有突起細胞占圖片所有細胞百分比的測定。凡長度大于細胞胞體最大直徑的突起被認定為生長突起。每個濃度為一組，每組包含6孔，每組平均攝取圖像20張圖片，每張圖片上測定符合標準的8個細胞的突起，實驗重復3次，在Photoshop下分別計數有突起細胞數量及圖片上細胞總數。

3.4Western blot檢測p-ERK1/2及p-Akt的蛋白水平Neuro-2a細胞長至70%～ 80%時加入1 nmol/L的BoNT/A HC，于加入BoNT/A HC后不同時點用0.25%胰蛋白酶含0.02% EDTA消化收集各時點細胞，2 000 r/min離心5 min后，用RIPA 裂解液[含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑(Sigma)]冰上裂解蛋白60 min，4 ℃，Bradford法蛋白濃度測定試劑盒(上海生工)蛋白定量。取30 μg 蛋白，煮沸10 min，10% SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入抗p-ERK1/2 (1∶2 000；CST)、抗p-Akt(1∶1 000；CST)、抗ERK1/2 (1∶1 000；CST)及抗Akt抗體(1∶1 000；CST)，4 ℃搖床孵育過夜充分洗滌后加入HRP 標記的羊抗兔IgG(1∶5 000；上海生工)室溫孵育1 h,EasySee Western blot kit發光液(全式金) 測定反應條帶灰度值，以GAPDH 作為內參照。

4統計學處理

計量數據以均數±標準差(mean±SD)表示。所有數據采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，應用單因素方差分析(One-way ANOVA)分析數據差異的顯著性，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1BoNT/A HC對Neuro-2a細胞軸突生長的影響

免疫熒光觀察3個時點的細胞均收集于同一代細胞，且培養條件一致。加入不同濃度BoNT/A HC后24 h、48 h和72 h時其神經軸突長度均較對照組細胞明顯增長，而且尤以BoNT/A HC 濃度為1 nmol/L時最為明顯(P<0.01)。具體來講，BoNT/A HC 作用24 h時，0.01 nmol/L與對照組相比細胞軸突長度雖有所增加，但差異不顯著。而其它各濃度組與對照組比較, 細胞突起明顯增長, 差異有統計學意義(P<0.05)，當BoNT/A HC作用48 h和72 h時，0.1 nmol/L、1 nmol/L及10 nmol/L組的細胞突起長度與對照組相比其差異也具有統計學意義(P< 0.05)。歸納起來，3個時點不同濃度BoNT/A HC均對Neuro-2a細胞突起的生長具有刺激作用，尤以濃度為1 nmol/L最為明顯，見圖1。

2BoNT/A HC刺激細胞突起數量增多

分別計數每張圖片中有軸突細胞數占細胞總數的百分比發現，隨著BoNT/A HC濃度的增加，有突起細胞所占百分比也隨之增加。BoNT/A HC 作用24 h后，0.01 nmol/L、0.1 nmol/L及1 nmol/L組具有突起的細胞百分比均較對照組有所增加。與促進細胞突起增長一樣，BoNT/A HC 濃度為1 nmol/L時，有突起細胞的百分比增多最為明顯。然而，實驗中觀察到，當BoNT/A濃度為10 nmol/L時，具有突起的細胞百分比并未繼續增加，反而稍有降低。BoNT/A HC 作用48 h及72 h后有突起細胞所占百分比與24 h類似，仍以1 nmol/L作用最為顯著。與此同時，0.01 nmol/L在各個時點與對照組相比雖有增加趨勢，但差異皆不顯著。總之，BoNT/A HC單一濃度作用的不同時點，有軸突細胞的百分比隨著作用時間的延長呈增加的趨勢，見圖2。

3BoNT/A HC促進Neuro-2a細胞中信號蛋白ERK1/2和Akt的磷酸化

基于前述實驗，采用1 nmol/L BoNT/A HC作為干預劑量，對BoNT/AHC作用于Neuor-2a細胞后不同時點信號蛋白ERK1/2和Akt的蛋白表達及磷酸化激活狀態進行檢測。

加入1 nmol/L 的BoNT/A HC后，ERK1/2的總量各組間無明顯差異，但是p-ERK1/2的水平則呈增加趨勢，BoNT/A HC作用時間≥60 min時， p-ERK1/2 的水平明顯增加，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，同時，p-ERK1/2的免疫熒光染色也呈現相同的趨勢。實驗中觀察到的另一個現象是：盡管在BoNT/A HC后，Neuro-2a細胞ERK1/2的磷酸化水平整體呈增加趨勢，但呈現60 min和4 h 2個時間峰值，見圖3。

加入1 nmol/L BoNT/A HC后，Western blot顯示Akt的總體水平無明顯變化，但p-Akt的水平呈現增加趨勢，尤以15 min和60 min明顯，與對照組比較差異顯著(P<0.05)。更有意思的是，Akt的磷酸化程度在加入BoNT/A HC后也呈現2個時間峰值, 分別是15 min 和60 min，見圖4。

上述結果均表明，BoNT/A HC可促進Neuro-2a細胞中ERK1/2和Akt信號蛋白磷酸化。加入BoNT/A HC后，p-ERK1/2和p-Akt的增強皆呈現時間上的雙峰值，且p-Akt激活峰值的出現早于p-ERK1/2。

討論

本研究表明BoNT/AHC具有促進神經突起再生的效應，其表現為BoNT/A HC作用于培養的Neuro-2a細胞不同時間后可刺激細胞突起增長，同時具有神經突起的Neuro-2a細胞的百分比明顯增加。BoNT/A HC的這種促神經突起再生效應在一定范圍內具有濃度依賴性。隨著BoNT/A HC濃度增加，其促神經突起增長的作用增強，這與前人有關肉毒素中毒后期神經末梢的出芽現象及體外肉毒素刺激運動神經突起再生有關的報道是一致的。研究中還觀察到，如果BoNT/A HC的劑量過高，譬如達到10 nmol/L時，其刺激神經突起再生的作用并不會進一步增加，反而有所降低。很少有研究調查這種發芽的細胞及分子機制，然而，關于肉毒素中毒后期的神經末梢出芽或體外促進神經突起再生的機制目前并不清楚，大多數人僅僅認為這種出芽很大程度上只是一種非特異性的化學去神經反應[6]。

Figure 1. Concentration-dependent effect of BoNT/A HC on the neurite outgrowth of Neuro-2a cells. The neurons were labeled with mouse anti-β-tubulin (red). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 nmol/L.

圖1BoNT/A HC對Neuro-2a細胞神經軸突長度的濃度依賴性影響

Figure 2.The neurite positive percentage of the Neuro-2a cells treated with different concentrations of BoNT/A HC at 24 h, 48 h and 72 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 nmol/L.

圖2不同濃度的BoNT/A HC在不同時點有軸突細胞占總細胞數的百分比

ERK1/2和Akt是目前公認的與細胞存活、再生相關的重要細胞內信號蛋白，二者通過上游信號分子激活后被磷酸化，以磷酸化的活性形式參與對下游信號通路的干預。ERK1/2是MAPK家族的主要成員之一，又稱p44/p42絲裂原活化蛋白激酶，為信號轉導的重要分子[7]。已經有報道一些神經生長因子如IGF-1、NGF和BDNF會促進MAPK/ERK再生信號通路而導致神經再生[8]，而以前的研究也表明ERK1/2能夠參與細胞的增殖、分化、細胞形態的維持及骨架的構建[9]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，PI3K/Akt信號通路的激活主要參與抑制細胞凋亡、促進細胞存活機制。PI3K可誘導無活性的 Akt 轉移至漿膜內表面，使其Ser473和Thr308位點磷酸化，從而使 Akt 活化(磷酸化)[10]。在上述基礎上，本研究的結果發現BoNT/A HC作用于Neuro-2a細胞后可引起細胞內ERK1/2和Akt信號蛋白磷酸化過程增強，且二者磷酸化增強皆表現出時間上的雙峰現象，其中p-ERK1/2的2個峰值為加入BoNT/A HC 后60 min和4 h；而p-Akt的增強則分別是15 min和60 min，比p-ERK1/2的激活呈現較早。由此，本實驗結果證實p-ERK1/2和p-Akt磷酸化的改變有可能是BoNT/A HC促進神經突起再生的重要信號蛋白和分子機制。目前已經證實，在神經系統里ERK1/2和Akt通常被神經營養因子(NGF和BDNF)激活，表現為磷酸化過程增強，從而參與促進神經元存活或神經突起再生[11]。文獻報道激活的Akt信號通路在神經細胞的生長發育、增殖、髓鞘形成、軸突再生和細胞凋亡方面起著重要的作用[12]；抑制 Akt 降解和促進 Akt 活化均可以促進軸突的形成和生長[13]。近年的研究也表明，PI3K/Akt 信號通路在微管組裝和動力學方面具有非常重要的作用[14]。微管系統和肌動蛋白絲是組成軸突細胞骨架的主要部分，它們之間的相互影響，對軸突的生長和延伸至關重要[15]。Markus等[16]的研究證實ERK1/2及Akt的磷酸化可以被同一種刺激所激活，在同一時點，Akt激活的倍數明顯高于ERK1/2。

小鼠神經母細胞瘤Neuro-2a細胞是由Klebe和Ruddle經A株白鼠的自生腫瘤建立[17]。Neuro-2a細胞株的主要組織來源是腦神經母細胞瘤和神經母細胞，形態似神經和阿米巴樣干細胞，具有神經干細胞的特征，培養時呈單層貼壁細胞生長狀態，普通培養條件下部分細胞可形成神經突起。另外，Neuro-2a細胞含有與BoNT/A HC結合的膜蛋白成分，因此培養液內加入BoNT/A HC可以引起Neuro-2a細胞膜上出現受體-配體復合物形成并激活相應細胞內再生相關信號蛋白。

除上述之外，本實驗中還觀察到BoNT/A HC作用于Neuro-2a細胞后ERK1/2和Akt的磷酸化增強呈現2個時間高峰。從時間的延續性看，Akt高峰值的出現早于ERK1/2，結果提示，當BoNT/A HC與細胞表面相應受體結合而激活細胞內信號蛋白時，Akt的激活要早于ERK1/2。但是這種時間延續上的信號蛋白磷酸化雙峰值的跳躍性增加的機制還不是十分清楚。Steinmetz等[18]采用卵巢癌原代細胞培養發現ERK1/2的磷酸化在癌細胞增殖過程中也呈時間上的雙峰表達現象, 并認為這種時間延續上的ERK1/2磷酸化的變化可能與MEK依賴性和非依賴性2種機制有關。有文獻報道，Akt和ERK1/2皆參與應激反應[19]。因此本研究中外源性給予BoNT/A HC時，Neuro-2a細胞是否也表現有早期應激反應尚待進一步證實，但是，ERK1/2及Akt磷酸化時間序列上的第一個峰值與應激反應有關的可能性是存在的。如果有這樣的可能，2種信號蛋白第一個磷酸化的高峰可能屬于應激反應，而隨后的長時程磷酸化增強高峰則可能才是受體-配體激活引起的細胞內信號蛋白的激活。

Figure 3.Phosphorylation of ERK1/2 affected by 1 nmol/L of BoNT/A HC treatment for different incubation time in Neuro-2a cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖3BoNT/A HC(1 nmol/L)作用不同時間對Neuro-2a細胞ERK1/2磷酸化的影響

綜上所述，BoNT/A或BoNT/A HC具有促神經再生的作用，其作用機制可能與其相關膜受體激活細胞內某些信號通路相關，BoNT/A HC與相應膜受體結合所激活的與ERK1/2及Akt相關的細胞內信號通路可能是BoNT/A HC促進神經突起增長的主要機制。然而，鑒于細胞各種信號蛋白質之間相互作用的復雜情況，BoNT/A HC與膜受體結合后所激活的細胞內信號通路尚未完全明了，因此，有關BoNT/A HC促進神經突起再生/增長的機制還需進一步深入研究。

Figure 4.Phosphorylation of Akt affected by 1 nmol/L of BoNT/A HC treatment for different incubation periods in cultured Neuro-2 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol.

圖4BoNT/A HC(1 nmol/L)作用不同時間對Neuro-2a細胞Akt磷酸化的影響

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

*[基金項目]浙江省自然科學基金青年基金資助項目(No.LQ15H150002)；國家自然科學基金資助項目(No.81571923)

Promoting effect of botulinum neurotoxin serotype A heavy chain on neuritogenesis in cultured Neuro-2a cellsGAO Mei-ling1, WANG Hong1, ZHANG Cai-yun2, LAN Jing1, LI Xia-qing1

(1DepartmentofPathophysiology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2TheFirstHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China.E-mail:xqli2013@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the neuritogenic actions of botulinum neurotoxin serotype A heavy chain (BoNT/A HC) on cultured Neuro-2a cells and to investigate the related signaling mechanisms for the effect of BoNT/A HC. METHODS: Neuro-2a cells were treated with different doses of BoNT/A HC (0.01, 0.1, 1 and 10 nmol/L), and then the cells were harvested at 24 h, 48 h and 72 h of BoNT/A HC exposure for detecting the neurite length and the percen-tage of the cells with neuronal processes by immunofluorescence staining. The most efficient dose of BoNT/A HC was chosen for exposure to Neuro-2a cells as the above. Whole cell protein was harvested at different time points for detecting the protein levels of phosphorylated ERK1/2 (p-ERK1/2) and phosphorylated Akt (p-Akt) by Western blot. RESULTS: Low doses of BoNT/A HC stimulated the neurite outgrowth, and increased the percentage of the cells with neurites compared with the negative controls (P<0.05), especially in the group with 1 nmol/L of BoNT/A HC treatment. Meanwhile, the phosphorylation of ERK1/2 and Akt was increased after treated with BoNT/A HC. There was an increasing tendency for the phosphorylation of ERK1/2 after the exposure of the cells to BoNT/A HC. The obvious increase in p-ERK1/2 was seen from 60 min to 5 h with 1 nmol/L of BoNT/A HC treatment (P< 0.05), and the increased protein level of p-Akt was mainly observed at 15 min and 60 min (P<0.05). CONCLUSION: BoNT/A HC stimulates the neuritogenesis. The neuritogenic mechanism of BoNT/A HC on Neuro-2a cells might be realized by activation of the phosphorylation of ERK1/2 and Akt.

[KEY WORDS]Botulinum neurotoxin serotype A heavy chain; Neuro-2a cell line; Neuritogenesis; Extracellular signal-regulated kinases; Protein kinase B

通訊作者△Tel： 0577-88069280； E-mail： zhangdan6250@yeah.net

[收稿日期]2015- 08- 07[修回日期] 2015- 09- 30

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2228- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.018

[中圖分類號]R392.12

[文獻標志碼]A