肺炎支原體經ROS激活NLRP3炎性體誘導RAW264.7細胞分泌IL-1β*

張　涵，　馬　晶，　張云凌，　張樹明，　許慶瑞，　王偉明

(黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036)

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肺炎支原體經ROS激活NLRP3炎性體誘導RAW264.7細胞分泌IL-1β*

張涵，馬晶，張云凌，張樹明，許慶瑞，王偉明△

(黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036)

[摘要]目的： 觀察肺炎支原體(Mycoplasma pneunoniae，Mp)促進NLRP3炎性體的活化及下游促炎性細胞因子白細胞介素-1β(IL-1β)的表達是否與活性氧簇(ROS)有關。方法: 預先用5 mmol/L ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預處理RAW264.7細胞30 min，用10 MOI Mp分別感染RAW264.7細胞4、8、16和24 h。流式細胞術檢測細胞內ROS水平；real-time PCR法檢測細胞NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表達；Western blot 法檢測NLRP3、ASC和caspase-1 p20的蛋白水平；ELISA法檢測細胞上清液IL-1β的分泌水平。結果: 與正常組比較，感染后4、8、16和24 h模型組ROS生成顯著增加(P< 0.01)；感染后8、16和24 h模型組NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表達顯著增加 (P<0.01)，感染后16和24 h NLRP3、ASC和caspase-1 p20的蛋白水平上調(P<0.01)，感染后24 h 細胞上清液IL-1β含量顯著增加(P< 0.01)；與模型組比較，NAC組在上述相應時點ROS生成降低，NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表達下調，蛋白水平下降，細胞上清液IL-1β的含量減少。結論: Mp可能通過刺激RAW264.7細胞生成ROS而激活NLRP3炎性體。

[關鍵詞]肺炎支原體； 活性氧簇； NLRP3炎性體； 白細胞介素1β

肺炎支原體 (Mycoplasmapneunoniae，Mp) 是一種無細胞壁結構的原核生物，不但能引起咽炎、支氣管炎、間質性肺炎等呼吸道感染，還可引起肺外多器官病變，而且與哮喘等疾病關系密切[1-2]。其發病機制可能與Mp侵入、直接吸附及其誘發的免疫異常有關，其中免疫異常越來越受到學者的關注[3-4]。NLRP3炎性小體與機體的固有免疫反應密切相關，多種病原相關分子模式及危險相關分子模式可激活炎性體，引起IL-1β等促炎細胞因子的生成，并導致下游炎性細胞因子的釋放[5-7]。前期實驗研究表明，Mp感染早期可激活NLRP3炎性體相關基因及上調IL-1β的表達[8]。本文旨在探討Mp感染RAW264.7細胞不同時點NLRP3炎性體相關基因、蛋白、IL-1β的變化并探討此過程是否與活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)有關。

材料和方法

1實驗材料含CARD結構

1.1細胞株RAW264.7細胞株，購自中山大學；肺炎支原體標準菌株(ATCC-15531) 購自ATCC。

1.2試劑與儀器PPLO培養基(Difico)；特級胎牛血清(杭州四季青)；DMEM培養液(Gibco)； 燕山鮮酵母(英聯馬利北京食品銷售有限公司)；N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC；碧云天生物技術研究所)；RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq均購自TaKaRa； NLRP3、含CARD結構凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)、caspase-1和HPRT引物由TaRaKa合成；NLRP3抗體、caspase-1 p20抗體和ASC抗體購自Abcam；IL-1β ELISA試劑盒(R&D)。SW-CJ-1F型潔凈工作臺(江蘇蘇凈集團有限公司)；1300 SERIES A2二級生物安全柜、3110 Series II水套式CO2培養箱、NANODROP 2000 核酸蛋白分析儀(Thermo)；BSP-250 生化培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；CFX96熒光定量PCR儀和凝膠成像儀(Bio-Rad)；Mastercycler PRO 溫度梯度 PCR 儀(Eppendorf)；GENios pro酶聯免疫檢測儀(TACAN)；Th1-200型倒置顯微鏡(Olympus)；Accuri C6流式細胞儀(BD)。

2方法

2.1細胞培養將RAW264.7細胞用含10% 胎牛血清的DEME培養液(內含100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞處于對數生長期時，收獲細胞。

2.2Mp培養將Mp標準菌株凍干粉用PPLO完全培養液(含胎牛血清、酵母提取物、酚紅、青霉素等)，充分混勻，放入37 ℃生化培養箱中培養，每日觀察其顏色變化，待培養液由紅變橙黃時傳代。將處于對數生長期的Mp，CCU定量，常規凍存，待用時用含10% 胎牛血清的DMEM培養液調至所需濃度。

2.3不同感染復數(multiplicity of infection，MOI)的Mp對細胞活力的影響 取對數生長期細胞按每孔1×104個細胞接種于96孔培養板，置37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養。24 h后棄去培養液，MP感染組分別按照MOI (Mp數∶細胞數) 100∶1、80∶1、40∶1、20∶1、10∶1加入Mp刺激；正常組加入等容量含10%胎牛血清的DMEM培養液。每組3復孔，置37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養24 h。每孔加入50 μL MTT，37 ℃孵育4 h。吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO振蕩10 min，用酶標儀于波長490 nm處檢測各孔吸光度 (A) 值。

2.4分組及方法實驗分3組，分別為正常組、Mp感染組、NAC組。取對數生長期的RAW264.7細胞接種于6孔細胞培養板，每孔1×105個。孵育24 h后，小心吸棄各培養孔中的培養液，正常組加入含10% 胎牛血清的DMEM培養液，每孔1 mL；Mp感染組：加入1×109CFU/L的Mp菌液，每孔1 mL；NAC組：加入1×109CFU/L的Mp菌液前30 min，加入5 mmol/L NAC孵育30 min。每組3復孔，分別置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養4、8、16、24 h后，收集細胞或者上清液進行相關指標的檢測。

2.5流式細胞儀檢測細胞內ROS表達收集細胞，溫PBS洗1遍，加入適量的含10 μmoL/L的DCFH的無血清培養基液，37 ℃避光溫育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻1次，使探針和細胞充分接觸，離心收集細胞，用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，上流式細胞儀檢測。

2.6Real-time PCR法檢測NLRP3炎性體相關基因表達小心吸棄每孔的培養液，加入1 mL RNAiso Plus，吹打數次，充分裂解細胞，按RNAiso說明書提取各組細胞總RNA，A260/A280均在1.8～2.0之間。按試劑說明書進行反轉錄及PCR 擴增。引物序列采用Primer Premier 5.0 軟件設計，NLRP3上游引物序列為5’-ACTGAAGCACCTGCTCTGCAAC-3’，下游引物序列為5’-AACCAATGCGAGATCCTGACAAC-3’，擴增產物為88 bp；ASC上游引物序列為5’-GCTGAGCAGCTGCAAACGA-3’，下游引物序列為5’-ACTTCTGTGACCCTGGCAATGA-3’，擴增產物為137 bp；caspase-1上游引物序列為5’-TGCCTGGTCTTGTGACTTGGA-3’，下游引物序列為5’-CCTATCAGCAGTGGGCATCTGTA-3’，擴增產物為94 bp；內參照HPRT上游引物序列為5’-TTGTTGTTGGATATGCCCTTGACTA-3’，下游序列為5’-AGGCAGATGGCCACAGGACTA-3’，擴增產物189 bp。PCR 擴增條件：95 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法行PCR 產物相對定量分析。

2.7Western blot法檢測NLRP3炎性體相關蛋白的表達提取培養細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。分別取各孔樣品蛋白50 μg，經過變性、電泳、半干轉或濕轉，轉移至PVDF膜，在含5% BSA的TBS緩沖液中封閉1 h，分別用相應稀釋濃度的 I 抗孵育，4 ℃過夜，TBST漂洗膜3次，用相應的 II 抗孵育2 h，TBST漂洗膜3次，ECL法顯色蛋白條帶。

2.8ELISA法檢測細胞培養上清液IL-1β的水平參照試劑盒說明書操作。

3統計學處理

采用SPSS 11.0統計軟件處理，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1不同MOI的Mp對RAW264.7細胞活力的影響

不同MOI的Mp感染RAW264.7細胞24 h，對其細胞活力均有不同程度抑制作用，其中100 MOI、80 MOI、40 MOI和20 MOI的Mp均可明顯抑制其細胞活力(P<0.05)。見圖1。

2Mp感染RAW264.7細胞ROS表達的動態變化

Mp刺激RAW264.7細胞4、8、16、24 h，ROS生成的水平明顯上升，與正常組比較，差異顯著(P<0.01)。上述時點，NAC可顯著下調MP感染引起的ROS表達(P<0.01)，見圖2。

Figure 1.MTT assay for testing cell viability of RAW264.7 cells infected with different MOI of Mp. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1不同MOI的Mp對RAW264.7細胞活力的影響

Figure 2.The expression of ROS in the RAW264.7 cells infected with Mp. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsMp group.

圖2Mp感染RAW264.7細胞不同時點ROS生成的變化

3Mp感染RAW264.7細胞后NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA表達的動態變化

與正常組比較，Mp刺激RAW264.7細胞8、16、24 h，均可顯著上調NLRP3、ASC和caspase-1的 mRNA表達(P<0.05)。上述時點，NAC可下調MP感染引起的NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表達(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The mRNA expression of NLRP3, ASC and caspase-1 in the RAW264.7 cells infected with Mp. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsMp group.

圖3Mp感染RAW264.7細胞不同時點NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA表達的變化

4Mp感染RAW264.7細胞后NLRP3、ASC和caspase-1 p20蛋白水平的動態變化

與正常組比較， Mp刺激RAW264.7細胞16和24 h，均可顯著增加NLRP3、ASC和caspase-1 p20的蛋白水平(P<0.05)。上述時點，NAC可減低NLRP3、ASC和caspase-1 p20低蛋白水平，與模型組比較，差異顯著(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The protein levels of NLRP3, ASC and caspase-1 p20 in the RAW264.7 cells infected with Mp. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsMp group.

圖4Mp感染RAW264.7細胞后不同時點NLRP3、ASC和caspase-1 p20 蛋白水平的變化

5Mp感染RAW264.7細胞后IL-1β分泌的動態變化

Mp感染RAW264.7細胞后4、8和16 h細胞培養上清液IL-1β分泌稍有上升，但與正常組比較，差異無統計學意義。Mp感染RAW264.7細胞24 h，可促進IL-1β的分泌，與正常組比較，差異顯著(P<0.01)。與模型組比較，NAC可下調Mp感染RAW264.7細胞24 h的IL-1β表達(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The concentration of IL-1β in the supernatant of cultured RAW264.7 cells infected with Mp. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsMp group.

圖5Mp感染RAW264.7細胞后不同時點RAW264.7細胞培養上清液IL-1β含量的變化

討論

NLRP3炎性體是由NLRP3、接頭蛋白(ASC)及caspase-1前體組成的一類大分子多蛋白復合體，屬于NOD樣受體家族成員，是機體胞漿中重要的模式識別受體。NLRP3可識別機體自身危險信號及細菌等外源性危險信號，當其被激活后，通過接頭蛋白ASC招募caspase-1前體，使其水解，產生 p20和p10大小亞基，形成p20/p10異二聚體，再形成4聚體，即有活性的caspase-1，進而對IL-1β、IL-18等前體進行剪切，促進有生物活性的IL-1β和IL-18釋放至細胞外，參與炎癥反應[5, 9]。金黃色葡萄球菌、幽門螺桿菌、呼吸道合胞病毒等多種病原微生物均可通過直接或者間接途徑激活NLRP3炎性體[10-12]。其激活機制尚不完全明確，目前有半通道模型、溶酶體破壞模型及ROS模型等3種假說[13]。

Mp為一類無細胞壁結構，大小介于細菌和病毒之間的原核微生物，是兒童及青少年時期社區獲得性肺炎的最常見病原體，可引起間質性肺炎及細支氣管炎[4, 14]。研究表明，肺炎支原體肺炎與機體免疫異常有關，肺炎支原體感染機體時，能否激活NLRP3炎性體？激活途徑如何，鮮有報道。

我們前期實驗研究發現，Mp感染RAW264.7細胞早期，不同MOI的Mp可激活NLRP3炎性體相關基因表達，其100 MOI的Mp可促進IL-1β的分泌[8]。為了進一步探討Mp的感染對NLRP3炎性體及IL-1β表達的影響及可能機制，本實驗在前期研究的基礎上，選用小鼠巨噬細胞RAW264.7為模型，首先考察了不同MOI的Mp與RAW264.7細胞共培養24 h對其細胞活力的影響，以選擇合適MOI的Mp復制模型。實驗結果表明：10 MOI的Mp與此細胞共同孵育24 h，對其細胞活力無明顯影響。在此基礎上，本研究探討了10 MOI的 Mp感染RAW264.7細胞4、8、16和24 h 4個時點NLRP3炎性體相關基因及蛋白以及IL-1β的動態變化，并用ROS抑制劑NAC為干預因素，以觀察ROS是否參與了此過程。實驗結果表明，Mp感染RAW264.7細胞4 h，ROS生成增加，感染8 h時，NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA表達上調；感染16 h NLRP3、ASC及胞漿內caspase-1的活化形式caspase-1 p20蛋白表達上調，感染24 h時，IL-1β表達上調，即NLRP3炎性體可能參與了Mp的炎癥反應，且Mp感染RAW264.7細胞后NLRP3炎性體的上游和下游因子變化的時點不相同。ROS的抑制劑NAC作用Mp感染的RAW264.7細胞24 h后，細胞內ROS水平下降，NLRP3炎性體相關基因、蛋白及IL-1β表達均下調，即ROS可能參與了Mp激活NLRP3炎性體的過程，此激活過程是ROS單獨參與還是與其它因素有關，有待于進一步在動物模型中加以研究和驗證。本研究為肺炎支原體肺炎的發病機制研究和藥物治療提供了新的思路。

(致謝：感謝廣州中醫藥大學脾胃研究所及中醫內科學國家重點學科實驗室在儀器使用中給予的幫助。)

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

*[基金項目]廣西高校科學技術研究項目(No.KY2015LX280)；桂林醫學院高層次人才科研啟動基金(No.KY2012087)

Mycoplasmapneumoniaeinduces IL-1β production through activating NLRP3 inflammasome by ROS in RAW264.7 cellsZHANG Han, MA Jing, ZHANG Yun-ling, ZHANG Shu-ming, XU Qing-rui, WANG Wei-ming

(HeilongjiangProvincialAcademyofSciencesofTCM,Haerbin150036,China.E-mail:wmzyyjy@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate whether Mycoplasma pneumoniae (Mp)-induced interleukin-1β (IL-1β) production in RAW264.7 cells is through the activation of NLRP3 inflammasome via reactive oxygen species (ROS). ME-THODS: RAW264.7 cells were randomly divided into 3 groups. In normal group, RAW264.7 cells were treated without Mp. In model group, RAW264.7 cells were treated with 1∶10 multiplicity of infection (MOI) of Mp. In NAC group, RAW264.7 cells were pretreated with N- acetylcysteine (NAC) at a concentration of 5 mmol/L for 30 min before infection with Mp. The RAW264.7cells were infected with Mp (1∶10 MOI) for 4, 8, 16 and 24 h in model group and NAC group, respectively. The intracellular ROS level was analyzed by flow cytometry. The mRNA expressions of NLRP3, ASC and caspase-1 were detected by real-time PCR. The protein levels of NLRP3, ASC and caspase-1 p20 were determined by Western blot. The levels of pro-inflammatory cytokine IL-1β in the supernatant were measured by ELISA. RESULTS: Compared with normal group, the production of ROS were significantly increased at 4, 8, 16 and 24 h after infection, the mRNA expression of NLRP3, ASC and caspase-1 were increased at 8, 16 and 24 h after infection, the protein levels of NLRP3, ASC and caspase-1 p20 were increased at 16 and 24 h after infection, and the releases of IL-1β were increased at 24 h after infection in model group (P<0.01). Compared with the model group, the level of ROS in NAC group decreased, so as the expression of NLRP3, ASC and caspase-1 at mRNA and protein levels and the releases of IL-1β in the supernatant at the corresponding time points. CONCLUSION: Mp may stimulate the ROS production to activate NLRP3 inflammasome in RAW264.7 cells.

[KEY WORDS]Mycoplasma pneumoniae; Reactive oxygen species; NLRP3 inflammasome; Interleukin-1β

通訊作者△Tel: 0773-5895291; E-mail: 31910753@qq.com

[收稿日期]2015- 05- 21[修回日期] 2015- 09- 14

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2249- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.022

[中圖分類號]363.2

[文獻標志碼]A