豬細小病毒病的診斷與防治研究進展

李 嬌，祖立闖，王金良，2，苗立中，2，李 峰，2，沈志強，2（.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600）

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豬細小病毒病的診斷與防治研究進展

李 嬌1，祖立闖1，王金良1，2，苗立中1，2，李 峰1，2，沈志強1，2
（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600）

摘 要：豬細小病毒是可以感染母豬和仔豬的一種病毒性傳染病，該病毒可以引起母豬的繁殖障礙，流產和產死胎及木乃伊胎，仔豬腹瀉和皮炎。該病毒在豬場經常發生感染，給養豬業帶來嚴重的經濟損失。通過綜述豬細小病毒的臨床診斷和分子生物學診斷及防治研究進展，旨在為疾病的預防和控制提供參考。

關鍵詞：豬細小病毒病；診斷；防治；研究進展

豬細小病毒(PPV)屬于細小病毒科細小病毒屬，為單股正鏈DNA病毒，豬細小病毒病發病率和感染率都很高，污染的飼料，飲水，食物都可以傳播病毒[1]。該病的發生季節性不明顯，一般每年的夏、春、秋三季都易感染發病[2]。該病的診斷包括臨床診斷和分子生物學診斷，該病的防治措施建議以疫苗免疫和加強飼養管理為主，現將豬細小病毒病的診斷與防制方法簡要介紹如下。

1　?臨床初步診斷

豬細小病毒感染可以引起母豬不孕，產死胎及木乃伊胎，懷孕母豬表現為不明原因流產，死胎有皮下出血及水腫，胸腹腔有黃色滲出液，肝脾腎腫大。仔豬表現皮炎和腹瀉。

2　?常規實驗室檢測方法

常規的實驗室檢測方法包括免疫熒光、病毒分離、血凝抑制實驗等。

2.1免疫熒光

免疫熒光是很直接和特異的豬細小病毒檢測方法，將豬細小病毒的組織病料1∶3比例加入滅菌生理鹽水，用研磨器研磨成組織勻漿，反復凍融3次，12 000 r/min離心取上清液，用濾器過濾除菌，取少量病毒濾液加到PK-15細胞培養瓶中，培養過程中觀察細胞病變，及時更換細胞液，培養6 d左右，將細胞反復凍融3次，離心取細胞上清液，取少量上清液再次接種PK-15細胞培養瓶，同樣方法盲傳3代，培養2～3 d進行病毒直接免疫熒光抗體實驗。通過鏡檢觀察，出現豬細小病毒特異性熒光的為陽性，否則為陰性。該方法特異性強，敏感性高，但實驗周期較長，不適合快速診斷。

2.2病毒分離

病毒分離是疾病診斷過程中很重要的一種方法，病毒處理過程同上，通過接種細胞，觀察病變特征等進行疾病診斷，該方法同樣實驗周期長，但在疾病的診斷過程中發揮很重要的作用。國內劉秀芬等[3]利用ST細胞培養，分離到一株豬細小病毒，該病毒通過在ST-細胞上盲傳6代開始出現細胞病變，呈現圓縮、融合、拉網等明顯有規律的細胞病變，盲傳到12代開始對豚鼠紅細胞有血凝作用，該研究為豬細小病毒的分離提供參考。Wu R等[4]分離到一株新型豬細小病毒，該病毒從臨床送檢的豬肺組織中檢出，通過對病毒基因組的測序和序列分析，證明該毒株與現有的豬細小病毒處于不同分支，該新型豬細小病毒的分子流行病學調查有待深入研究。

2.3血凝抑制實驗

由于豬細小病毒具有血凝性，可以凝集人O型血和豚鼠紅細胞，利用病毒的這一特性可以進行血凝抑制實驗來進行疾病診斷。通過特異性的豬細小病毒陽性血清與豬細小病毒中和而產生血凝抑制，該方法敏感性不高，不能作為疾病診斷的唯一方法，可以在疾病的診斷過程中提供參考。

3　分子生物學診斷方法

豬細小病毒的分子生物學診斷方法包括常規的PCR檢測方法，熒光定量PCR檢測方法，LAMP檢測方法，現簡要介紹如下。

3.1PCR檢測方法

PCR檢測方法是豬細小病毒檢測最常用的方法，但普通的PCR檢測方法敏感性不顯著，國內崔宇超等[5]建立了豬細小病毒的高效納米PCR檢測方法，該檢測方法比普通的PCR檢測方法敏感性提高1000倍，最低核酸檢出量為4拷貝/μL，利用該檢測方法檢測其他豬病毒核酸，檢測結果均為陰性，說明該檢測方法有很好的特異性，分別采用納米PCR和普通PCR對3個省份送檢的43份臨床樣品檢測，PPV陽性率分別為95 %和72 %，說明納米PCR檢測方法有更高的敏感性，更適合PPV低含量臨床樣品的檢測。

3.2熒光定量PCR檢測方法

熒光定量PCR檢測方法具有很高的敏感性，但所需的儀器設備及檢測試劑均較貴，一般用于病毒的精確定量研究。劉崇靈等[6]建立了豬細小病毒的SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法，檢測不同接毒條件對病毒增殖效果的影響。結果表明，ST細胞覆蓋率接近單層時接毒，采用分步接毒法，接種病毒后感作2 h，接毒后細胞維持液中血清濃度設為2 %可以提高PPV細胞培養的病毒滴度。鄧蘭蘭等[7]建立了豬細小病毒與豬偽狂犬病毒(PRV)的二重SYBR Green I實時熒光PCR檢測方法，對豬細小病毒和豬偽狂犬病毒檢測的靈敏度分別達到248拷貝/μL和160拷貝/μL，是普通PCR檢測方法的100倍，實現了兩種病毒的同時檢測，能夠對PRV和PPV混合感染的臨床病料進行快速診斷。Gava D等[8]建立了新型豬細小病毒(PPV4)的實時熒光定量PCR檢測方法，選取PPV4保守的ORF3基因設計檢測引物，該熒光PCR檢測方法最低可以檢出9.5X10拷貝DNA/μL，與其他的豬病毒沒有交叉反應，有很好特異性，用該檢測方法檢測272份樣品，陽性率為13.2%，比普通PCR方法敏感10倍，該熒光PCR檢測方法可以作為新型豬細小病毒的臨床樣品檢測方法，用于豬群的流行病學調查。

3.3LAMP檢測方法

環介導等溫擴增技術(LAMP)是一種恒溫核酸擴增技術，該技術具有特異性高，敏感性好，操作簡單，反應快速，成本低廉等優點，結果判定直接用肉眼觀察，比較直觀。陳星瑤等[9]建立了豬細小病毒的LAMP檢測方法，針對豬細小病毒的VP2基因設計特異性檢測引物，通過反應條件的優化，最終確定LAMP反應溫度可以選擇60 ℃、62 ℃、64 ℃、66 ℃中任一溫度，LAMP反應的擴增時間為45 min，在60 ℃反應條件下45 min最低可以檢出10個拷貝的模板，與其他豬病病毒沒有交叉反應，有很好的特異性。豬細小病毒LAMP檢測方法為豬細小病毒的診斷提供了一種簡單、快速、敏感、便捷的檢測方法，適用于豬細小病毒的臨床檢測，具有良好的應用前景。

4　?防治

豬細小病毒的綜合防控以預防措施為主，包括定期消毒和疫苗免疫接種，做好養殖場環境衛生，加強飼養管理等。

4.1疫苗免疫接種

豬細小病毒的疫苗有很多種，包括滅活疫苗，基因工程亞單位疫苗，基因工程活載體疫苗等。各種疫苗各有優缺點，按照各自的免疫要求及時免疫接種，一般都能起到免疫保護作用。確保疫苗的質量，應使用獸醫主管部門推薦或國家定點專業生物制品廠生產的疫苗，疫苗的運輸、保存和使用均應在低溫條件進行，嚴防日曬和高溫。注射部位應消毒，注射要確實，嚴禁用大號、短針頭注射和打飛針，避免注射部位過淺和劑量不足，不能漏注少注。定期進行血清學抗體監測、排除母源抗體干擾，隨時掌握豬群的免疫抗體水平，依據抗體監測結果制定科學合理的免疫程序并不斷調整，使豬群有整齊、保持高效價的抗體水平。

4.2加強飼養管理和環境衛生

良好的環境衛生是防止豬細小病毒病暴發的前提條件，及時清理豬舍中糞便、污水，定期做好圈舍消毒，且應經常更換或交替使用消毒藥物，避免產生耐藥性。飼料要合理搭配，配制全價平衡日糧，可配合應用一些中草藥飼料添加劑也具有抗菌抗病毒的作用，禁止飼喂霉變飼料。飲水要保持新鮮、清潔。建立檔案管理制度，對每頭種豬、每一批仔豬從出生到出售均應獨立建檔，并作好記錄，歸檔保存。

5　?結語

豬細小病毒病的診斷與防治是一項綜合性的系統工程，隨著我國規模化養殖的快速發展，動物疫病多種病原的混合感染與繼發感染日益嚴重，給獸醫臨床診斷增加了難度，對于豬細小病毒病的診斷，筆者建議應結合自身實驗室的試驗條件與優勢選擇一種或二種實驗室診斷方法對臨床疑似病例進行確診。對于豬細小病毒病的防治，筆者建議應采取加強飼養管理和環境衛生，確保疫苗免疫效果為主的預防措施。總之，豬細小病毒病的診斷與防治中，只有采取早預防、早發現、早確診、早治療、早淘汰的綜合性診治方法，才能逐步實現豬細小病毒病凈化，提高養豬生產經濟效益。

參考文獻

[1]殷震，劉景華.動物病毒學[M].北京：科學出版社，1997：681-688.

[2]許英民.豬細小病毒流行特點及其防制措施[J].獸醫導刊，2015 (5)：57-58.

[3]劉秀芬，姜艷平，唐麗杰，等.豬細小病毒HLJ-DN株分離鑒定[J].東北農業大學學報，2014，45(6)：74-78.

[4]WU R，WEN Y，HUANG X，et al.First complete genomic characterization of a porcine parvovirus 5 isolate from China[J].Arch Virol，2014，159(6)：1533-1536.

[5]崔宇超，彭永剛，馬興杰，等.豬細小病毒高效納米PCR檢測方法的建立[J].中國預防獸醫學報，2014，36(4)：286-288.

[6]劉崇靈，劉曉波，胡呈才，等.豬細小病毒SYBR Green I實時熒光定量PCR方法檢測不同接毒條件對病毒增殖效果的影響[J].湖南畜牧獸醫，2014(3)：7-9.

[7]鄧蘭蘭，金鉞，李明鳳，等.豬細小病毒與豬偽狂犬病毒二重SYBR Green I實時熒光PCR方法的建立與檢測[J].中國獸醫學報，2014，34(5)：690-694.

[8]Gava D，Souza C K，Schaefer R A，et al.TaqMan-based real-time PCR for detection and quantification of porcine parvovirus 4[J].J Virol Methods，2015，219(7)：14-17.

[9]陳星瑤，張子群，王曉龍.豬細小病毒LAMP檢測方法的建立[J].中國動物保健，2014，16(8)：9-12.

(收稿日期：2015-07-30)

作者簡介：李嬌，女，遼寧人，碩士，助理研究員，主要從事動物疫病診斷及疫苗研究

基金項目：山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目（SDAIT-06-022-15）