當歸補血微囊膠原海綿促進傷口愈合的效果觀察

陳海軍，潘立群

(南京中醫藥大學 1.第一臨床醫學院，江蘇 南京 210023；2.附屬昆山市中醫醫院腫瘤外科，江蘇 昆山 215600)

當歸補血微囊膠原海綿促進傷口愈合的效果觀察

陳海軍1, 2，潘立群1

(南京中醫藥大學 1.第一臨床醫學院，江蘇 南京 210023；2.附屬昆山市中醫醫院腫瘤外科，江蘇 昆山 215600)

當歸補血湯是補氣生血代表劑。黃芪甲苷和阿魏酸分別是黃芪和當歸中代表性的活性成分[1-2]。膠原蛋白海綿作為生物支架材料，可止血及促進組織愈合，可體內降解、組織相容性好[3]，將藥物微囊化后與膠原海綿相結合，可以形成更長效的緩控釋制劑。本實驗中，當歸補血微囊以當歸補血湯為原型，以黃芪甲苷和阿魏酸5:1配比，制成微囊后混合吸收進入膠原海綿[4]，通過建立大鼠損傷模型，探討當歸補血微囊膠原海綿促進傷口愈合的作用。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠，♀♂各半，體質量(230±10)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 主要藥品與試劑 醫用膠原蛋白海綿，無錫貝迪生物工程有限公司。黃芪甲苷微囊、阿魏酸微囊、當歸補血微囊及空白微囊膠原海綿均由南京中醫藥大學中藥藥劑教研室提供。

1.3 主要儀器 顯微鏡，BX43型，OLYMPUS公司；電泳系統，Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD公司；凝膠成像儀，ChemiDoc XRS+ System，Bio-RAD公司；OD值測量儀器，高精度分光光度計，Merinton SMA4000；定量PCR儀，CFX connect Real-Time PCR System。

2 方法

2.1 SD大鼠損傷模型的建立 縱行切開麻醉大鼠背部皮膚全層，皮下形成2 cm×2 cm的口袋，建立SD大鼠損傷模型。各組大鼠分別于背部左右側各置入相應的2 cm×2 cm微囊無菌膠原海綿，縫合切口。

2.2 動物分組給藥及標本采集 60只SD大鼠，♀♂各半，隨機分為模型對照組(僅無菌膠原海綿)、陰性對照組(含空白成囊材料)、阿魏酸組(含阿魏酸微囊12.5 μg)、黃芪甲苷組(含黃芪甲苷微囊62.5 μg)和當歸補血微囊組(含阿魏酸12.5 μg、黃芪甲苷62.5 μg制成混合微囊)。造模14 d后處死大鼠，取微囊膠原海綿周圍肉芽組織進行檢測。

2.3 指標的檢測

2.3.1 病理學檢測 肉芽組織HE染色、CD34染色和masson染色。

2.3.2 Western blot檢測p-STAT3、VEGF蛋白表達 常規方法提取肉芽組織總蛋白，一抗分別為磷酸化兔抗人STAT3單克隆抗體和兔抗人VEGFA多克隆抗體，二抗為羊抗兔Ig G，ECL化學發光顯影，分析各條帶光密度。

2.3.3 VEGF mRNA以及miRNA表達檢測 提取各組肉芽組織總RNA進行逆轉錄反應。實驗結果由熒光定量PCR分析軟件BIO-RAD CFX Manager自動進行統計和計算。

3 結果

3.1 當歸補血微囊膠原海綿對創傷大鼠傷口愈合的影響 HE染色結果顯示，當歸補血微囊組肉芽組織血管及成纖維細胞大量增生，且明顯增生活躍。CD34染色結果顯示，黃芪甲苷組、阿魏酸組和當歸補血微囊組微血管計數均高于模型對照組和陰性對照組(P<0.01)。masson染色結果顯示，3個微囊給藥組膠原纖維密度均勻，排列有序。

3.2 當歸補血微囊膠原海綿對創傷大鼠肉芽組織p-STAT3、VEGF蛋白表達的影響 Western blot檢測結果顯示，當歸補血微囊組肉芽組織中p-STAT3、VEGF表達較模型對照組和陰性對照組均明顯增加，可見當歸補血微囊可激活STAT3和VEGF，從而誘導新生血管形成。

3.3 當歸補血微囊膠原海綿對創傷大鼠肉芽組織VEGF mRNA以及miRNA-21基因表達的影響 RT-PCR檢測結果顯示，與模型對照組比，黃芪甲苷組可提高VEGF mRNA的轉錄水平，當歸補血微囊組可明顯提高VEGF mRNA的轉錄水平；黃芪甲苷組和當歸補血微囊組均可明顯上調miRNA-21的轉錄水平。

4 討論

創面修復愈合是一個連續的復雜過程，肉芽組織形成是創面修復愈合的關鍵步驟之一，而肉芽組織的本質是毛細血管和成纖維細胞[5-6]。本實驗從整體動物層面中HE染色肉芽組織增生情況、CD34標記的微血管數量、masson染色膠原纖維生成情況，蛋白層面中STAT3蛋白磷酸化水平和VEGF水平，以及基因層面中VEGF mRNA和miRNA-21的表達等不同層次遞進展開。綜上所述，當歸補血微囊可以促進肉芽組織血管及成纖維細胞大量增生，促進創面毛細血管生成，促進膠原纖維生成，進而促進肉芽組織生成，實現其促進損傷模型大鼠傷口愈合的作用，其作用機制可能是通過激活STAT3和VEGF蛋白表達，上調VEGF mRNA和miRNA-21基因轉錄水平。

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Effect observation of collagen sponge with Angelica microcapsules for replenishing blood to promote wound healing

CHEN Hai-jun1,2, PAN Li-qun1

(1.TheFirstClinicalMedicalCollege,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China; 2.DeptofOncosurgery,TraditionalChineseMedicineHospitalofKunshanAffiliatedtoNanjingUniversityofChineseMedicine,KunshanJiangsu215600,China)

當歸補血微囊；膠原蛋白海綿；傷口愈合；HE染色；CD34染色；masson染色；STAT3；VEGF；miRNA-21

Angelica microcapsules for replenishing blood; collagen sponge; wound healing; HE staining; CD34 staining; masson stain; STAT3; VEGF; miRNA-21

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.056.html

2016-08-11,

2016-09-27

國家自然科學基金資助項目(No 81373534);高等學校博士學科點專項科研基金項目(No 20123237110003)

陳海軍(1964-)，男，博士生，主任醫師，研究方向：腫瘤外科，E-mail：ksschj@126.com； 潘立群(1949-)，男，教授，主任中醫師，博士生導師，研究方向：中醫外科，通訊作者，E-mail：cr_ane@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.028

A

1001-1978(2016)12-1775-02

R-332；R282.71；R289.5；R64