皮膚致敏試驗替代方法的研究進展

陳 寧，王 平，冼靜雯，謝天柱，秦美容，李俊鵬，魯 藝，王曉煒，石海寧，龍紹蓉

(1.深圳市藥品檢驗研究院，深圳 518057;2.哈佛大學醫學院麻省總醫院，波士頓 02114; 3.鄭州大學基礎醫學院，鄭州 450000)

“3R”

皮膚致敏試驗替代方法的研究進展

陳 寧1，王 平1，冼靜雯1，謝天柱1，秦美容1，李俊鵬1，魯 藝1，王曉煒1，石海寧2，龍紹蓉3

(1.深圳市藥品檢驗研究院，深圳 518057;2.哈佛大學醫學院麻省總醫院，波士頓 02114; 3.鄭州大學基礎醫學院，鄭州 450000)

皮膚致敏(過敏性接觸性皮炎)是皮膚接觸某些小分子化合物而引起的遲發性超敏反應。經典的檢測化學物接觸致敏性的方法是通過動物試驗來檢測，鑒于歐盟于2013年頒布全面禁止化妝品動物試驗的規定，替代試驗將來是化學品/化妝品致敏研究的主要趨勢，本文綜合近年的國內外文獻，對現行的通過OECD認證的和正在開展研究的皮膚致敏替代試驗，如LLNA、DPRA、KeratinoSensTM、h-CLAT試驗等進行綜合論述和評估，為未來體外替代試驗能夠客觀、公正的對致敏結果評估提供參考。

皮膚致敏;過敏性接觸性皮炎;體外替代

皮膚致敏(skin sensitization)(過敏性接觸性皮炎allergic contact dermatitis，ACD)是皮膚對外源物質產生的免疫原性皮膚反應，對于人類這種反應以瘙癢、紅斑、丘疹、水皰、融合水皰為特征。動物反應可能為皮膚紅斑和水腫［1］。經典的檢測化學物接觸致敏性的方法是豚鼠最大值試驗(guinea pig maximization test，GPMT)及局部封閉涂皮試驗(Buehler test，BT)［2］，但這些試驗需要大量的動物。目前國際上對動物福利的呼聲越來越高，歐盟現行化妝品法規1223/2009/EC于2009年頒布，2013年7月全面生效，取代 1976年頒布的 76/768/EC指令，成為歐洲化妝品行業的統一法規，新法規繼續保留了禁止動物試驗的規定［3］，加強替代方法的研發投入與支持，鼓勵替代方法的運用，將成為未來藥品化妝品安全性評價的主要趨勢。

1 皮膚致敏體內替代試驗

1.1 小鼠局部淋巴結試驗 (local lymph node assay，LLNA)

LLNA是用小鼠代替豚鼠對化學物致敏性進行檢測，它是最早通過認證的皮膚致敏替代方法，2002年世 界 經 合 組 織 (Organization forEconomic Cooperation and Development，OECD)將其作為化學物致敏性檢測的標準方法，即 OECD TG-429［4］。相比傳統的豚鼠法LLNA優勢更加明顯，在于它周期短，減少了動物的使用量，優化了受試物給藥方法，減少了動物的痛苦，只需要建立誘導階段，靈敏度高，能辨別低分子量的致敏化學物［5］。

由于LLNA不能很好地區分致敏物和刺激物，在某些皮膚致敏物質試驗中會出現假陰性或者假陽性結果，如氯化鎳、硫酸鎳、十二烷基硫酸鈉等，且需使用放射性核素，易造成環境污染［6］。國內外不少學者對試驗方法改進，如增加刺激性指標如耳緣厚度和耳重的檢測［7］;分析免疫表型 B220+［8］，CD69+［9］等;將淋巴結增殖情況(稱重和計數)納入致敏性指標［10］。2010年，OECD又增加了兩種新的方法，即 LLNA:DA方法(TG442A)［11］和 LLNA: Brdu-ELISA方法(TG442B)［12］。這兩種方法彌補了TG429方法放射性物質的污染的缺陷，但仍有一定制約性，如LLNA:DA的試驗結果受檢測時間影響較大，OECD標準要求:從取淋巴結到檢測過程須在20 min內完成，且每只動物的檢測時間要保持一致，從處死到 ATP檢測約在 30 min內完成［11］。LLNA:BrdU-ELISA法難免存在由于皮膚刺激劑或者呼吸道致敏劑引發的假陽性對檢測的干擾［12］。

2.2 正在研究和驗證的LLNA改良法

近幾年，研究者們繼續對LLNA改良法進行不斷改進和探索［13-16］，Ulker［13］對LLNA:Brdu方法進行改良，增加淋巴結細胞的Th1型和Th2型細胞因子的指標測定，對三種不同的致敏物質，結果表明改良LLNA:Brdu和放射性LLNA方法的致敏檢測結果一致性良好。陽曉燕［14］用 LLNA:DA改良法對4種化妝品原料和6種化妝品產品進行致敏檢測，增選耳厚差、耳重為刺激指標，淋巴結重量、淋巴細胞數和 ATP發光值為致敏指標，將刺激指標和致敏指標結合對化妝品刺激性和致敏性做出綜合評價。

Yamashita等［15］用一種包含激發階段的改良法—LLNA:DAE法區分LLNA:DA檢測中出現的邊界陽性化合物，并進行交叉致敏測試。該方法對實驗動物右耳背部進行4次化學物質接觸誘導，最后對左耳背部進行激發反應，通過測試發現包括邊界陽性的24種化學物質中，23種化學物質的檢測結果與 LLNA方法一致。Yamashita［16］等對 LLNA: DAE法進行進一步探索試將其作為一種獨立的皮膚致敏檢測方法來評估不同之間的相對皮膚致敏效力，他對3種化學物(己基肉桂醛、異丁子香酚和2，4-二硝基氯苯)進行初步劑量研究，發現32種化合物的左耳淋巴結激發反應程度和致敏效力之間存在一定的定性關系。

目前，利用流式細胞術對LLNA改良方法(flow cytometry-based LLNA，FC-LLNA)包括:(1)流式細胞術檢測細胞增殖:流式細胞術(flow cytometry，FCM)能通過測定淋巴結細胞中的 BrdU快速、靈敏地檢測細胞增殖［17］;(2)流式細胞術檢測細胞亞群及致敏相關標志物:如CD40L，CD62L等［18］;(3)流式細胞術進行致敏相關細胞因子檢測:IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNFα［19］。該方法在敏感度和準確率方面展示出較好的前景，但仍未通過OECD的方法學認證［20］。

2 皮膚致敏體外替代試驗

2.1 直接肽反應試驗 Direct Peptide Reactivity Assay(DPRA)

化學物穿透皮膚后，大多數化學物可與皮膚蛋白質結合形成穩定的免疫復合物啟動免疫反應。由于這些化學致敏原大多是親電性的，因此可以與氨基酸的親核中心共價結合。DPRA實驗的設計是通過量化包含半胱氨酸和賴氨酸的合成肽模型的化學物質的活性，來模擬親電子化學物質和親核中心的共價結合過程。該試驗研究肽反應動力學，將受試物孵育24小時后，用高效液相HPLC測肽的殘留量來評價化學物質的致敏性，它能將化合物按照不同致敏程度進行分類［21］。

該方法由 Gerberick和他的同事在 2004年開發［22］，2007年進行改良［23］。為了拓寬該方法的使用范圍，2009年Gerberick又進一步改良，在致敏物與半胱氨酸的酶促反應中加入了辣根過氧化物酶—過氧化氫(HRP/P)，使該方法也能用于抗原前體物的檢測［24］。2013年，歐洲替代方法研究中心(European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing(EURL-ECVAM)將其作為皮膚致敏替代試驗的推薦方法［25］，2015年2月，OECD公布DPRA試驗方案(TG442C)［21］。

2.2 樹突狀細胞檢測法

樹突狀細胞DC能將抗原遞呈給初級免疫T細胞，調節T細胞、B細胞介導的免疫應答，皮膚朗格罕細胞(Langerhans cell，LC)是主要位于表皮的未成熟樹突狀細胞(iDC)。在抗原遞呈的過程中，iDC捕獲和處理抗原，刺激T淋巴細胞活化并引起多種生物學變化，通過檢測DC生物學指標的變化，可評價化學物的致敏性。目前，檢測比較成熟的細胞因子是 IL-1β，TGF和 TNF-α，膜表面分子主要有CD86，CD54，和MHC II［26、27］。

LC樣樹突狀細胞模型來源主要是誘導培養CD34+造血干細胞和外周血獲得的樹突狀細胞，但此類細胞模型存在著不足:實驗室之間、來源個體間差異性、、費用昂貴等。為克服這些限制，目前一些來源廣泛，活力較強的各類單核細胞系(THP1、U937和 MUTZ-3等)成為目前研究的熱點內容［29］。

2.3 人細胞系激活實驗 (human cell line activation test，h-CLAT)

由于人單核白血病細胞 THP-1(human monocytic leukaemia cell line)能表現出與樹突細胞類似的性質，并在細胞因子的作用下分化為樹突樣細胞。當與致敏物接觸時，THP-1細胞表面的CD86和 CD54表達增強，從而使其成為有效的評價皮膚致敏的體外研究方法［30］。h-CLAT試驗采用THP-1進行體外皮膚致敏研究，通過檢測細胞表面標志物CD86和 CD54的變化來反映化學物的致敏性。THP-1細胞不需要細胞因子誘導，即可被致敏物激活，目前細胞已商品化，對常用致敏物檢測特異性高。h-CLAT法已經初步獲得認可，通過不同國家實驗室間的合作研究驗證，歐洲替代方法研究中心(EURL-ECVAM)已完成了對它的可行性驗證［31］，2015年12月，OECD已經公布了 h-CLAT的方法草案［32］。

Ashikaga等［33］通過檢測細胞 CD86和 CD54的表達水平對100種化學物致敏性的進行判定，h-CLAT與 LLNA結果的一致性仍然高達 84%，h-CLAT不僅能分辨出極度致敏和強致敏，而且能分辨出中度致敏和弱致敏。Parise等［34］發現給藥暴露48 h后，可以用h-CLAT法通過分析THP-1的CD86的表達水平將23種致敏物質的22種鑒定出來，結合CD86和IL-8的分析對致敏物做綜合判斷。

2.4 ARE-Nrf2熒光素酶檢測法(KeratinoSensTM)

Nrf2是攜帶有亮氨酸拉鏈結構的轉錄因子，幾乎能在所有細胞中表達，它含6個功能區，分別被命名為Neh1～6。正常情況下，其在胞質中通過 Neh2與阻遏蛋白Keap1蛋白結合而被降解。當機體處于氧化應激狀態或體內的氧化磷酸化作用可以促使Nrf2與Keap1解體，隨后 Nrf2轉位進入細胞核，在各個功能區的密切配合下與抗氧化/親電反應元件(antioxidant/electrophile response element，ARE)結合，啟動 Nrf2-ARE信號通路并促使下游II相解毒酶和抗氧化酶基因的表達［35］。

HaCaT(human keratinocytes)是人類永生化角質細胞，包含有ARE元件的熒光素酶報告基因，Nrf2-ARE檢測就是利用HaCaT細胞檢測熒光素酶的活力水平來判斷細胞是否有致敏反應。EURL ECVAM公布的數據顯示，該方法在不同實驗室間的可重復率達到85%，準確性和 LLNA相比達到77%，特異性達到76%，并于2014年2月推薦該方法的試驗方案［36］，2015年2月OECD公布了該方法的指導原則(TG442D)［37］。

2.5 人工皮膚/重建表皮模型

現在主要有兩種類型的體外三維培養人皮膚模型:表皮類似物或皮膚類似物。

已經商品化并被歐盟推薦使用的重組人皮膚模型有EpiskinTM、EpidermTM和SkinEthic RHE［38］等，張廣靜［39］等研究表明永生化細胞組織工程皮膚模型檢測的敏感性和特異性均高于原代培養細胞構建的皮膚模型。Ramadan等［40］2016年模擬皮膚內環境，利用動態灌流微培養系統構建人永生化細胞HaCaT和人白血病單核淋巴細胞(U937)共培養的三維模型。曹玉萍［41］等將 THP-1細胞分別與 KC和色素性組織工程表皮共培養三維模型，通過檢測THP-1細胞表面的標記物變化及培養液中細胞因子的變化來判斷待檢物質的致敏性。

2.6 結構活性關系分析

化合物的生物學特性與其化學結構密切相關，有許多理論電腦模型能利用與未知化學物結構近似的已知化學物的現有理化資料預測該未知化學物的理化特性。如結構活性關系分析(structural activity relationship，SAR)和定量結構活 性 分 析 ( quantitative structural activity relationship，QSAR)。Gould［42］將LLNA實驗中存在潛在致敏力的28種化合物(EC3＜1%)用計算機進一步DEREK分析，從結構，理化性質方面，如分子量，LogP等參數，結合結構性預警分析和理化分析對LLNA結果進行綜合判斷，結構性分析顯示其中13種化合物陰性，15種化合物陽性，所有化合物的分子量均小于550 Da，對其中21種化合物進行 EC3值分析，8種是 EC3值的數量級是正確的，8種不正確，5種不能判定。通過結合計算機結構及理化分析能對LLNA結果做出更準確的判斷。Urbisch［43］等用QSAR Toolbox方法和DPRA方法相比在致敏性判斷結果上有84%的一致性。其中非致敏物質判斷一致性83% ～100%，致敏物質判斷一致性55% ～61%。Dimitrov等［44］在 2015年建立一種對體內、體外測試試驗(DPRA vs.LLNA)結果轉換時進行數據整合和分析的統計學方法，這套方法的分級和篩選方式不僅能用于皮膚試驗評估，還能用于化學物體內外毒理和健康評價及QSAR模型的建立。

目前還沒有一種體外測試方法的結果能完全代替動物試驗單獨用于化學物皮膚致敏性評估，每一種體外方法只能反應皮膚致敏不良反應結局路徑(AOP)中的一部分關鍵信息，不能完整的反應整個皮膚致敏機制過程。一種新的替代方法的建立首先必須具備能體現3R原則、科學、有效及可操作性等優勢，經歐盟驗證實驗室(EU-NETVAL)驗證其數據可重復性，與體內動物試驗方法要有相關性和一致性，其結果能夠較好地預測受試物的毒理學及生物學效應。然后國際和各國權威部門組織同行評議和方法學驗證，如ECVAM、ICCVAM(NICEATM)等。再后，根據專家的評估意見提交相關管理部門，如歐盟委員會評估同意接受可成為歐盟方法納入法規管理的軌道。如要成為 OECD的標準，還需更廣泛機構的驗證和反復修改，還要聽取社會評論，才能發布為OECD的試驗指南。［45，46］近年來，研究人員采用組合測試策略(ITS)將DPRA、h-CLAT、KeratinoSensTM結合LLNA和計算機模擬的數據組合分析、已涵蓋皮膚致敏的各階段的生化反應數據，構建皮膚致敏性評價的框架。Urbisch［47］等結合DPRA，KeratinoSensTM和h-CLAT三種檢測方式，將27種抗原前體物中的22種檢測出來，陽性致敏率達到81%。Strickland等結合了LLNA，DPRA，h-CLAT和ARE-Nrf2熒光素酶檢測法建立一種整體評估策略，利用計算機QSAR Toolbox分析影響皮膚滲透力的6種相關理化性質參數，建立 54種不同的 QSAR Toolbox計算機模型。

經過20多年的不斷研究和探索，致敏免疫反應分子研究的逐漸清晰，為體外構建可靠的化學物致敏性評價體系奠定了理論基礎，隨著歐盟相關法規禁止使用動物實驗進行化妝品安全性評價的推進，致敏體外替代實驗的研究進程也在不斷加快，更多的經過歐洲替代方法驗證中心(ECVAM)確認的方法正在得到認可，替代實驗的研究具有廣闊的前景，我國在替代實驗研究方面剛剛起步，應加快替代實驗在國內實驗室的普及和開展，推動替代實驗的不斷發展。

［1］彭雙清，郝衛東，伍一軍.毒理學替代法［M］.北京:軍事醫學科學出版社，2009:63-84.

［2］OECD.OECD guideline for the testing of chemicals，skin sensitization［S］.Paris:OECD，1992.http://www.oecdilibrary.org/environment/test-no-406-skin-sensitisation_9789264070660-en.

［3］Zuang V，Barroso J，Bremer S，et al.ECVAM technical report on the status of alternative methods for cosmetics testing(2008-2009)［R］.European Union，2010.http://staging-ecvam. jrc.it/publication/JRC58991_2010-05-30-ecvam% 20technical%20report%202008-2009%20final%20_3.doc［1］.pdf.

［4］OECD.OECD guideline for the testing of chemicals，skin sensitisation:local lymph node assay［S］.Paris:OECD，2010. http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-429-skinsensitisation_9789264071100-en.

［5］程樹軍，焦紅.實驗動物替代方法原理與應用［M］.北京:科學出版社，2010:227-250.

［6］Kimber I，Dearman RJ，Basketter DA，et.al.The local lymph node assay:past，present and future［J］.Contact Dermatitis，2002，47(6):315-28.

［7］劉珍，劉俊平，萬旭英，等.化妝品安全性評價中小鼠局部淋巴結試驗方法的改進［J］.衛生研究，2009，38(5):585 -589.

［8］Gerberick FG，Cruse LW，Ryan CA，et al.Use of a B cell marker(B220)to discriminate between allergens and irritants in the local lymph node assay［J］.Toxicol Sci，2002，68:420 -428.

［9］Lee JK，Park SH，Byun JA，et al.Evaluation of lymphocyte subpopulations in draining lymph node cells following allergen and irritant［J］.Environ Toxicol Pharm，2004(17):95-102.

［10］Ehling G，Hecht M，Heusener A，et al.An European interlaboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay:First round［J］.Toxicol，2005(212):60-68.

［11］OECD.OECD guideline for the testing of chemicals，skin sensitization:local lymph node assay:DA［S］.Paris:OECD，2010.http://iccvam.niehs.nih.gov/SuppDocs/FedDocs/OECD/OECD-TG442A.pdf.

［12］OECD.OECD guideline for the testing of chemicals，skin sensitisation:local lymph node assay:BrdU-ELISA［S］.Paris: OECD，2010.http://iccvam.niehs.nih.gov/SuppDocs/FedDocs/OECD/OECD-TG442B.pdf.

［13］Ulker OC，Ates I，Atak A，et al.Evaluation of non-radioactive endpoints of ex vivo local lymph node assay-BrdU to investigate select contact sensitizers［J］.J Immunotoxicol，2013，10(1):1 -8.

［14］陽曉燕，趙康峰，孔建，等.局部淋巴結改良法在化妝品皮膚刺激性和致敏性檢測中的應用［J］.環境與健康雜志，2013，30(4):312-316.

［15］Yamashita K，Shinoda S，Hagiwara S，et al.Development of LLNA:DAE:a new local lymph node assay that includes the elicitation phase，discriminates borderline-positive chemicals，and is useful for cross-sensitization testing［J］.J Toxicol Sci，2014，39(1):147-161.

［16］Yamashita K，Shinoda S，Hagiwara S，et al.Further development of LLNA:DAE method as stand-alone skin-sensitization testing method and applied for evaluation of relative skin-sensitizing potency between chemicals［J］.J Sci，2015，40(2):137 -150.

［17］Kim DE，Yang H，Jang WH，et al.Predictive capacity of a nonradioisotopic locallymph nodeassayusingflow cytometry，LLNA:BrdU-FCM:Comparison ofa cutoffapproach and inferential statistics［J］.J Pharmacol Toxicol Methods，2016，78:76-84.

［18］Zhu X，Cole SH，Kawabata TT，et al.Characterization of the draining lymph node response in the mouse drug allergy model:A model for drug hypersensitivity reactions［J］.J Immunotoxicol，2015，12(4):376-384.

［19］Jung KM，Jang WH，Lee YK，et al.B cell increases and ex vivo IL-2 production as secondary endpoints for the detection of sensitizers in non-radioisotopic local lymph node assay using flow cytometry［J］.Toxicol Lett，2012，209(3):255-263.

［20］ICCVAM.The murine local lymph node assay:A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/ compounds:The results ofan IndependentPeer Review Evaluation Coordinated by the ICCVAM and the NICEATM［S］. 2013，https://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/docs/immunotox_ docs/llna/llnarep.pdf

［21］OECD.OECD guideline for the testing of chemicals，In:Chemico Skin Sensitisation Direct Peptide Reactivity Assay(DPRA)［S］.Paris:OECD，2010.http://www.oecd-ilibrary.org/ environment/test-no-442c-in-chemico-skin-sensitisation_9789264229709-en.

［22］Gerberick GF，Vassallo JD，Bailey RE，et al.Development of a peptide reactivity assay for screening contact allergens［J］. Toxicol Sci，2004，81(2):332-343.

［23］Gerberick GF，Vassallo JD，Foertsch LM，et al.Quantification of chemical peptide reactivity for screening contact allergens:A classification tree model approach［J］.Toxicol Sci，2007，97 (2):417-427.

［24］Gerberick GF，Troutman JA，Foertsch LM，et al.Investigation ofpeptide reactivity ofpro-hapten skin sensitizers using a proxiodase-peroxide oxidation system［J］.Toxical Sci，2009，112:164-174.

［25］EURL ECVAM.Directpeptidereactivityassay(DPRA) validation study report［S］，2012.https://eurl-ecvam.jrc.ec. europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/EURL-ECVAM-RECDPRA-DRAFT-ver02August2013.pdf/view.

［26］Boislève F，Kerdine-R?mer S，Pallardy M.Implication of the MAPK pathways in the maturation of human dendritic cells induced by nickel and TNF-alpha［J］.Toxicol，2005，206(2): 233-244.

［27］Ryan CA，Kimber I，Basketter DA，et al.Dendritic cells and skin sensitization:Biological roles and uses in hazard identification［J］.Toxicol Appl Pharm，2007，(221):384 -394.

［28］Jung YS，Kato R，Tsuchiya T.Biodegradable polymers Induce CD54 on THP-1 Cells in skin sensitization test［J］.Int J Biomater，2011:424571.

［29］Peiffer JL，Leon F，Tissier MH.Comparison of MUTZ-3，THP-1 and U-937 cell lines as in vitro predictive models for contact sensitization［J］.Toxicol Lett，2007，172:89-90

［30］Ashikaga T，Yoshida Y，Hirota M，et al.Development of an in vitro skin sensitization test using human cell lines:the human Cell Line Activation Test(h-CLAT).I.Optimization of the h-CLAT protocol［J］.Toxicol in Vitro，2006，20(5):767-773.

［31］EURLECVAM，RecommendationonthehumanCellLine Activation Test(h-CLAT)for skin sensitisation testing［S］. 2015.https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvamrecommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-humancell-line-activation-test-h-clat-for-skin-sensitisation-testing.

［32］OECD.OECD Guideline for the testing of chemicals draft proposal for a new test guideline，In vitro skin sensitization: human cell line activation test(h-CLAT)［S］.Paris:OECD，2015.https://www.oecd.org/env/ehs/testing/151216-Draft-h-CLAT-TG-After-Expert-Meeting-(clean)-Final.pdf

［33］Ashikaga T，Sakaguchi H，Sono S，et al.A comparative evaluation of in vitro skin sensitisation tests:the human cell-line activation test(h-CLAT)versus the local lymph node assay (LLNA)［J］.Altern Lab Anim，2010，38(4):275-284.

［34］Parise CB， Sá-Rocha VM， Moraes JZ.Skin sensitizer identification by IL-8 secretion and CD86 expression on THP-1 cells［J］.Toxicol in Vitro，2015，30(1 Pt B):318-324.

［35］董渠龍，王華，侯海燕，等.Nrf2-ARE信號通路功能的研究進展［J］.國際婦產科學雜志，2015，42(4):425-428.

［36］EURL-ECVAM.Recommendation on the KeratinoSensTMassay for skin sensitization testing［S］.2014.http://ihcp.jrc.ec. europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/ recommendation-keratinosens-skin-sensitisation.

［37］OECD.OECD Guidelines for the Testing of Chemicals，In Vitro Skin Sensitisation:ARE-Nrf2 Luciferase Test Method［S］. Paris:OECD，2015.http://www.oecd.org/env/test-no-442din-vitro-skin-sensitisation-9789264229822-en.htm.

［38］McKim JM Jr，Keller DJ 3rd，Gorski JR.An in vitro method for detecting chemical sensitization using human reconstructed skin models and its applicability to cosmetic，pharmaceutical，and medical device safety testing［J］.Cutan Ocul Toxicol，2012，31 (4):292-305.

［39］張廣靜，卓金士，金巖，等.人的原代上皮角質形成細胞和永生化的上皮角質形成細胞 HaCaT的增殖能力的比較［J］.現代生物醫學進展，2011，11(1):68-70.

［40］Ramadan Q，Ting FC.In vitro micro-physiological immunecompetent model of the human skin［J］.Lab Chip，2016，16 (10):1899-1908.

［41］曹玉萍，體外化學物質致敏性檢測模型和組織工程皮膚真菌感染模型的構建［D］.北京協和醫院博士論文.2011，5.

［42］Gould JC，Taylor S.Hazard identification of strong dermal sensitizers［J］.Toxicol Mech Methods，2011，21(2):86 -92.

［43］Urbisch D，Honarvar N，Kolle SN，et al.Peptide reactivity associated with skin sensitization:The QSAR Toolbox and TIMES compared to the DPRA［J］.Toxicol in Vitro，2016，14(34): 194-203.

［44］Dimitrov S，Detroyer A，Piroird C，et al.Accounting for data variability，a key factorin in vivo/in vitro relationships: application to the skin sensitization potency(in vivo LLNA versus inDPRA)example［J］.J Appl Toxicol，2016，［Epub ahead of print］.

［45］程樹軍，徐崇輝，潘芳，等.歐洲化學品新法規下危險評價的動物試驗及其替代方法［J］.中國衛生檢驗雜志，2008，18 (12):2846-2848.

［46］OECD.OECD Guidance Document on the Validation and InternationalAcceptance ofNew or Updated Test Methods for Hazard Assessment［S］.OECD Paris，2004，34:1267.

［47］Urbisch D，Becker M，Honarvar N，et al.Assessment of preand pro-haptens using nonanimal test methods for skin sensitization［J］.Chem Res Toxicol，2016，29(5):901-913

Research progress of alternative in vitro methods to evaluate skin sensitization

CHEN Ning1，WANG Ping1，XIAN Jing-wen1，XIE Tian-zhu1，Qin Mei-rong1，LI Jun-peng1，LU Yi1，WANG Xiao-wei1，SHI Hai-ning2，LONG Shao-rong3
(1.Shenzhen Institute for Drug Control，Shenzhen，518057，China;2.Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School，Boston，02114，USA;School of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou，450000，China)

Skin sensitization(allergic contact dermatitis，ACD)，is a serious condition caused by small reactive molecules and is characterized by a delayed-type hypersensitivity.Animal tests were usually used in the evaluation of sensitizing potential of chemical substances in the past.However，there is an increasing interest from the public for reducing and ultimately replacing animal tests.The European Union(EU)has posed a ban on animal testing of cosmetic ingredients that includes skin sensitization since 2013.Therefore，alternative in vitro tests are the main tendency in chemical substances and cosmetic sensitizing potential research in the future.In this study，different kinds of in vitro test methods that were adopted by OECD or on research(LLNA，DPRA，KeratinoSensTM，h-CLAT)were reviewed through recent years literature，comprehensive introduction and evaluation were made to obtain reliable hazard and potency information on potential skin sensitizers.

Skin sensitization;Allergic contact dermatitis;Alternative in vitro testing;Cosmetics

R-33

A

1671-7856(2016)12-0085-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.12.017

2016-06-14

深圳市藥品檢驗研究院重點學科團隊建設項目。

陳寧(1982-)，主管藥師，博士，研究方向:藥理毒理學，E-mail:cn82cn@163.com。

王平(1972-)，主任藥師，博士，研究方向:藥理毒理學，E-mail:wangping662@sina.com。