小鼠諾如病毒熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用

高 潔，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050)

小鼠諾如病毒熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用

高 潔，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050)

目的建立小鼠諾如病毒(murine norovirus，MNV)實時熒光定量PCR檢測方法，為建立MNV規范化檢測方法提供依據。方法根據NCBI公布的60個MNV病毒株核酸序列設計特異性引物，構建標準陽性質控品，建立MNV實時熒光定量PCR方法，并進行特異性、靈敏度、重復性及穩定性評價。用該方法對766只送檢小鼠的盲腸內容物樣品進行檢測，初步了解北京地區實驗小鼠MNV感染狀況。結果成功建立MNV實時熒光定量PCR檢測方法，該方法特異性好，與同種屬人類諾如病毒(HuNoVs)、貓杯狀病毒(FCV)均無交叉反應，檢測靈敏度可達101copies/μL。批內及批間CT值變異系數均小于2%。應用該方法在766份小鼠盲腸內容物樣品中檢出301份MNV核酸陽性樣品，陽性率39.3%。結論建立的MNV實時熒光定量PCR檢測方法特異性好，靈敏度高，重復性好，可以用于MNV的快速定量檢測。

鼠諾如病毒MNV;實時熒光定量PCR;檢測

【Key words】Murine norovirus;Fluorescent quantitative PCR;Detection

諾如病毒(murine norovirus，MNV)屬杯狀病毒科諾如病毒屬，是無囊膜的單股正鏈RNA病毒，核酸大小為7.4～7.6 kb。其原型MNV-1最早從信號轉導蛋白和轉錄激活因子1(STAT1)與重組體激活基因2(RAG2)缺陷(RAG2-/-/STAT1-/-)小鼠中分離得到。MNV-1可致免疫缺陷(STAT1-/-，STAT1-/-/PKR-/-，RAG-/-/STAT1-/-)小鼠腹瀉或死亡，也可致干擾素受體缺失(IFNαβγ-/-)小鼠出現高致死性［1］。MNV感染正常小鼠無明顯臨床癥狀［2］，其感染小鼠后主要侵染免疫細胞［3］(樹突狀細胞核巨噬細胞)。有研究表明 MNV感染可提高小鼠細小病毒 (mouse parvovirus，MPV)含量并延長其排毒時間［4］。此外，MNV感染可使腸道固有層(lamina propria，LP)、腸系膜淋巴結(mesenteric lymph node，MLN)等處的樹突狀細胞cDCs (conventional dendritic cells)數量下降［5］。

MNV是目前唯一能在體外有效增殖的諾如病毒［3］，其可在鼠巨噬細胞RAW264.7細胞進行傳代培養并引起細胞病變效應，為諾如病毒分子機制的研究提供了細胞培養系統，也使得MNV成為研究人類諾如病毒(human norovirus，HuNoVs)生物學特征的最佳替代模型［6，7］。

小鼠是目前廣泛使用的實驗動物之一，其微生物狀況是影響實驗數據有效性和重現性的重要因素。目前，國內外有關 MNV感染機制和檢測方法的研究迅速發展，全球多項研究表明MNV在實驗動物設施中有很高的感染率［8，9］。歐洲實驗動物科學聯合會(FELASA)、國際實驗動物科學協會(ICLAS)、美國Charles River實驗室等已將MNV列入實驗小鼠常規檢測項目，我國尚未將MNV列入實驗小鼠質量控制的國家標準，本實驗旨在建立特異、靈敏、快速、定量精準的 MNV實時熒光定量PCR檢測方法，為我國建立MNV規范化檢測方法提供依據。

1 材料和方法

1.1 病毒及檢測樣品

小鼠諾如病毒(MNV)BJ10-2062［10］由本實驗室分離保存;MNV-1(CW1)、RAW264.7細胞購自美國ATCC公司，編號分別為 PTA-5935，TIB-71;貓杯狀病毒(feline calicivirus，FCV)由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供;人諾如病毒(human norovirus，HuNoVs)由中國食品藥品檢定研究院腸道病毒室提供;pMD19-T simple vector質粒標準品委托寶生物工程(大連)有限公司合成;766份小鼠盲腸內容物樣品來源于北京9個送檢單位。

1.2 實驗動物及實驗環境

SPF級KM小鼠，SPF級BABL/c小鼠，SPF級C57BL/6小鼠，SPF級 NIH小鼠(實驗單位使用許可證號:SYXK(京)2011-0008，生產許可證號: SCXK(京)2014-0013，質量檢測單位:國家實驗動物質量檢測中心)。

1.3 主要試劑及儀器

RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit、Cador? Pathogen 96 QIAcube? HT Kit)購自德國Qiagen公司;100 bp DNA marker、Taq HS酶、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP)、10 x PCR buffer及 SYBR@Premix Ex TaqTMGC(Perfect Real Time)均購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR 儀:美國 ABI公司 Veriti 96 well Thermal cycler;全自動核酸提取儀:德國 Qiagen公司QIAcubeHT;核酸瓊脂糖凝膠電泳儀:美國 Bio-Rad公司 PowerPac Basic;凝膠成像分析儀:美國 Kodak公司 GL212Pro;熒光定量 PCR儀:美國 ABI公司7500 Fast Real-Time PCR System。

1.4 標準陽性質控品的制備

將MNV BJ10-2062基因保守區域(5018-5450 nt)連接至 pMD19-T simple vector構建標準陽性質控品，該片段包含引物所要擴增的片段并可進行熔解曲線分析。連接完成后，將重組質粒轉染至大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆并測序鑒定。提取質粒，用紫外分光光度計測定A260nm和A280nm A值，計算質粒濃度，并分裝保存于 -20℃。

1.5 引物的設計

將NCBI公布的60個MNV分離株全基因組序列進行比對，分析其共有的保守序列，采用 ABI PrimerExpress 3.0實時熒光定量 PCR引物設計軟件，設計擴增用引物4對，從擴增效率、特異性、靈敏度等方面分析，選擇最佳引物MNV-4F、MNV-4R。引物由美國 ABI公司合成。序列如下(表1):

1.6 實時熒光定量 PCR擴增體系的建立

分析擴增效率、熔解曲線等數據，優化熒光定量PCR反應體系中使用的引物、模板、PCR MIX濃度，確定最佳反應體系(表2)。設定不同退火溫度，確定最佳反應條件為:95℃預變性30 s;然后95℃10 s，60℃ 30 s，共40個循環，在每個循環延伸結束時采集熒光信號，最后進行熔解曲線分析。在反應管中按表2體系加樣，每個樣品做3個重復。

用含有目的片段的質粒pMD19-T vector作為標準陽性質控品，根據公式 copies/μL=(6.02×1023) ×(ng/μL×10-9)/(base pairs×660)，計算質粒標準品拷貝數。將標準質粒作為模板梯度稀釋為1.1 ×108copies/μL～1.1×101copies/μL，進行實時熒光定量PCR反應，建立標準曲線。

表1 MNV熒光定量PCR引物Tab.1 The sequences of primers used for amplification of MNV gene

表2 MNV熒光定量PCR反應體系Tab.2 Real-time PCR reaction system of MNV

1.7 實時熒光定量 PCR方法的特異性、重復性和穩定性試驗評價

以貓杯狀病毒(FCV)、人諾如病毒(HuNoVs)及RAW264.7細胞作為對照，檢測 MNV實時熒光定量 PCR方法的特異性;用本方法對 106copies/ μL，105copies/μL，104copies/μL 3個不同濃度標準陽性質控品進行檢測，重復檢測3個次批，每批次做5個重復，計算試驗內、試驗間變異系數，評價本方法的重復性和穩定性。

1.8 實時熒光定量 PCR方法的靈敏度實驗

將質粒標準品作為模板梯度稀釋為1.1×109copies/μL ～1.1×100copies/μL，進行熒光定量PCR反應，每個濃度的標準品做3個重復。所能檢測的最小濃度的循環閾值(CT)≤ 35，據此得出該方法的檢測靈敏度。

1.9 實時熒光定量 PCR方法的初步應用

利用該方法檢測來自北京9個送檢單位的766份小鼠樣品。取小鼠盲腸內容物樣品于 500 μL PBS溶液中，渦旋振蕩，12 000 r/min離心5 min，取上清液，用全自動核酸提取儀提取 RNA，逆轉錄后以 cDNA為模板檢測小鼠盲腸內容物。每次設108～101copies/μL標準品及 RAW264.7細胞陰形對照。標準品、陰性對照及樣品做3個重復。

以 MNV BJ10-2062細胞培養物經口感染8周齡雌性 KM、BABL/c、C57BL/6、NIH四個品系的小鼠，自染毒24 h起每間隔24 h取其糞便，用實時熒光定量 PCR方法進行檢測。于染毒10、21、56 d后取小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、小腸、大腸、盲腸、卵巢、子宮、胸腺組織及盲腸內容物進行檢測。此外，將正常小鼠與陽性小鼠同籠飼養，并檢測正常小鼠糞便樣品。

判斷標準:建立的標準曲線參數 slope在 -3～-3.5之間、R2大于0.99、擴增效率在90% ～110%之間，可以判定實驗成立，建立的方法可用于定量檢測［11］。

陽性判定標準:樣品循環閾值(CT)＜35，判定該樣品檢測結果為陽性;循環閾值(CT)≥35，不能確定被檢樣品是陽性樣品，結果判定為陰性。

1.10 實時熒光定量PCR檢測方法與ELISA檢測方法的比較

采集同一只小鼠的盲腸內容物與血清666份，分別進行熒光定量 PCR核酸檢測和重組抗原ELISA抗體篩查，比較兩種檢測方法的陽性檢出率。

2 實驗結果

2.1 標準陽性質控品的制備

陽性克隆載體經測序鑒定，測序結果與 MNV BJ10-2062分離株核苷酸序列進行比對，符合率為100%。表明標準陽性質控品構建成功，可作為MNV熒光定量PCR檢測的陽性標準品。

根據公式 copies/μL=(6.02×1023)×(ng/μL ×10-9)/(DNA length×660)，計算質粒標準品濃度為7.9×1010copies/μL，取出部分樣品稀釋至1.1× 109copies/μL，分裝保存于-20℃。

2.2 實時熒光定量 PCR擴增體系及標準曲線的建立

對反應體系及反應條件進行優化，得到 MNV擴增曲線結果(圖1)。其循環閾值(CT)為20.03，拷貝數為2.59×105copies/μL，分析其熔解曲線(圖2)，可知熔解曲線為單峰，無非特異性反應。

用含有目的片段的質粒標準品作為模板，梯度稀釋為1.1×108～1.1×101copies/μL，進行熒光定量PCR反應，得到陽性質控品的擴增曲線和標準曲線。擴增曲線(圖3)各稀釋梯度間距均等，擴增效率為98.32%。標準曲線(圖4)的線性范圍是1.1 ×107～1.1×102copies/μL，線性相關系數 slope為-3.216，R2值為0.998，表明線性明相關性高，定量結果有效、可靠。建立的標準曲線參數符合標準的規定范圍，可用于定量檢測。

2.3 實時熒光定量 PCR檢測方法的特異性、重復性和穩定性試驗評價

2.3.1 實時熒光定量 PCR檢測方法特異性檢測結果:分別以MNV BJ10-2062、HuNoVs、FCV 及RAW267.4細胞核酸提取物為模板進行熒光定量 PCR反應，結果如圖5所示，可以看出以 HuNoVs、FCV、RAW264.7細胞為模板，擴增曲線為直線無擴增，而以MNV BJ10-2062為模板的擴增曲線明顯。說明建立的熒光定量PCR檢測方法具有良好的特異性。

2.3.2 實時熒光定量 PCR檢測方法重復性和穩定性檢測結果:以起始濃度分別為 1.1×106copies/ μL、1.1×105copies/μL、1.1×104copies/μL質粒標準品為模板，分別進行五次試驗內重復和三次試驗間重復，計算試驗內和試驗間CT值、定量拷貝數的標準差和變異系數，結果見表3。結果顯示，三個濃度的最終實測定量拷貝數分別為 1.074×106copies/μL、1.118×105copies/μL、1.092×104copies/μL，單次試驗內循環閾值(CT)的變異系數(CV)分別為0.3%、0.3%、0.05%，試驗間循環閾值(CT)的變異系數(CV)分別為 1.1%、0.6%、0.8%，變異系數均小于2%，表明此方法精密度高，具有良好的重復性和穩定性。

2.4 實時熒光定量 PCR檢測方法靈敏度檢測結果

以質粒標準品作為模板，10倍梯度稀釋為109copies/μL～100copies/μL，進行熒光定量 PCR反應，結果顯示擴增曲線(圖6)各稀釋度間距均勻，標準曲線(圖7)線性范圍良好。可以看出標準品稀釋到1.1×101copie/μL時有明顯擴增曲線，CT值為33.871，拷貝數為1.08×101copie/μL，在可檢測范圍之內;標準品稀釋到1.1×100copie/μL時擴增曲線為水平直線無擴增，超出可信范圍。因此，認為該法的最低檢測限度為10 copies/μL，具有良好的靈敏度。

2.5 實時熒光定量 PCR檢測方法的應用

將所建立的實時熒光定量 PCR方法應用于北京市9個送檢單位的766份小鼠盲腸內容物樣品的檢測。出現疑似陽性的樣品進行復檢，每個樣品做3個重復，對部分拷貝數較高的樣品進行普通 PCR反 應 (MNVCF: CAGATCACATGCTTC CCAC; MNVCR:AGACCACAAAAGACTCATCAC)并測序驗證。在766份小鼠盲腸內容物樣品中檢出陽性樣品301份，陽性率39.3%，測序結果顯示檢出樣本與MNV BJ10-2062序列同源性高達97%以上。

以MNV BJ10-2062經口感染8周齡雌性 KM、BABL/c、C57BL/6、NIH四個品系的小鼠，結果顯示各品系小鼠自染毒24 h即開始排毒，排毒時間約為30 d。染毒10 d、21 d后取小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、小腸、大腸、盲腸、卵巢、子宮、胸腺組織及盲腸內容物進行檢測，結果顯示染毒10 d、21 d的小鼠其脾臟、大腸、小腸、盲腸及盲腸內容物均有陽性檢出，其中，以盲腸和盲腸內容物病毒拷貝數最高(圖 8，9)。有文獻［12］報道在肝臟中也可檢出MNV，本次實驗未在肝臟中檢出，可能與病毒株感染能力差異、感染劑量及個體差異有關。正常小鼠與陽性小鼠同籠飼養48 h后糞便中有陽性檢出。

表3 MNV qPCR檢測試驗內及試驗間重復性Tab.3 Repeatability of the intra-assay and inter-assay of MNV real-time PCR detection

圖1 MNV擴增曲線Fig.1 Amplification curve of the MNV

圖2 MNV擴增熔解曲線Fig.2 The melting curve of MNV

圖3 1.1×108～1.1×101copies/μL標準質粒擴增曲線Fig.3 Amplification curves of 1.1×108to 1.1×101copies/μL standard

2.6 實時熒光定量 PCR檢測方法與ELISA檢測方法的比較

對同一只小鼠的盲腸內容物和血清分別進行熒光定量PCR核酸檢測和重組抗原ELISA抗體篩查，結果顯示，在 666份小鼠樣品中，熒光定量PCR檢測方法檢出陽性樣品 291份，陽性率為44%，ELISA檢測方法檢出陽性樣品224份，陽性率為33%，熒光定量PCR陽性檢出率較高。兩種檢測方法均為陽性的樣品為198份，占樣品總數的30%。

圖4 1.1×108～1.1×103copies/μL標準質粒的標準曲線Fig.4 The standard curve of 1.1×108to 1.1×103copies/μL standard

圖5 MNV特異性實驗擴增曲線Fig.5 The amplification curve of MNV specificity experiment

圖6 1.1×109～1.1×100copies/μL標準質粒擴增曲線Fig.6 Amplification curves of the 1.1×109to 1.1×100copies/μL standard

3 討論

MNV是小鼠中傳播最廣泛的感染因子之一，國外多項研究表明MNV在動物設施中都有很高的感染率［8，9］。有研究表明［9］日本和美國小鼠群體中MNV抗體陽性率分別高達67.3%和62.5%。西歐對多個設施中的大、小鼠微生物狀況進行檢測，結果顯示在小鼠群體中，MNV感染率最高，陽性率為31.8%［8］。我國廣東［13，14］、北京［15］、上海［16］均有MNV感染相關報道，袁文首次報道我國廣東省實驗小鼠中有MNV陽性檢出，采用RT-PCR方法檢測得小鼠 MNV陽性率為37.38%(77/206)［14］，熒光定量 PCR方法測得 MNV陽性率為 29.94%(103/ 344)［13］。隨后，醫科院動物所對北京地區600多只小鼠進行 ELISA檢測，結果顯示 MNV感染率為11.67%，其中，陽性小鼠主要來自實驗設施(30.94%)［15］。向丹丹等［16］對上海地區80份自然感染的小鼠糞便樣本進行RT-PCR檢測，結果顯示MNV陽性率為13.75%。實時熒光定量PCR檢測方法與ELISA相比，可定量檢測小鼠MNV在體感染狀況，且與RT-PCR相比，其靈敏度更高。

目前國外已有關于MNV熒光定量PCR方法的文獻報道［17，18］，國內有根據 MNV-1序列設計引物構建Taqman探針法的相關報道［13］。前兩種方法均比對了44個MNV分離株核酸序列，國內報道的方法主要以MNV-1序列為參考設計引物，現NCBI上公布的MNV分離株全基因組序列已有60株，MNV作為高突變率和增殖周期短的RNA病毒，其原有的保守序列有個別堿基發生變異，各分離株間核酸序列差異更加顯著，因此，有必要建立更為廣譜、高效的方法檢測 MNV在小鼠中的感染情況。此外，Kitajima等［17］建立的 Taqman探針法檢測限為1.0 ×102copies/μL，本次建立的檢測方法與其相比靈敏度更高。

本實驗所建立的MNV熒光定量PCR檢測方法特異性好，不與同種屬其他病毒產生非特異性反應，線性范圍廣，可快速精準定量。批間及批內實驗CT值變異系數均小于2%，表明其重復性和穩定性好，可以用于MNV核酸的定量檢測。用該方法對北京市9個送檢單位的766只小鼠盲腸內容物樣品檢測，其陽性率為39.3%，6個送檢單位有陽性檢出。對送檢樣品分析，發現 MNV感染呈集中趨勢，不同批次的陽性樣品多來自同一送檢單位，且MNV感染以動物實驗設施為主，其原因可能與MNV傳播途徑及持續性感染有關。小鼠感染MNV后主要經糞口途徑傳播，如污染的食物、水或墊料等，也有文獻報道MNV可經空氣傳播［19］，相同飼養間的小鼠均可能感染，污染設施很難通過檢測和淘汰清除MNV［20］。人工染毒實驗表明 MNV的主要靶器官是腸道組織及脾臟，排毒時間為30 d左右。對同一只小鼠的盲腸內容物和血清分別進行熒光定量PCR檢測和 ELISA檢測，結果顯示熒光定量PCR陽性檢出率為44%(291/666)，高于ELISA陽性檢出率(224/666)。

本實驗建立了特異、高效的 MNV熒光定量PCR檢測方法，為保障實驗動物微生物質量和加強進出口動物檢驗檢疫提供技術支撐，也為MNV分子機制、感染特征等研究提供了依據。

圖7 1.1×109～1.1×101copies/μL標準質粒的標準曲線Fig.7 Standard curve of the 1.1×109to 1.1×101copies/μL standard

圖8 盲腸擴增曲線(10 d)Fig.8 The amplification curve of cecum

圖9 盲腸內容物擴增曲線(10 d)Fig.9 The standard curve of caecum content

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Establishment and preliminary application of a real-time fluorescent quantitative PCR assay for detection of murine norovirus

GAO Jie，HE Zheng-ming
(Laboratory Animal Institute，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 10050，China)

ObjectiveTo establish a real-time fluorescent quantitative PCR(FQ-PCR)method for detection of murine norovirus(MNV)in laboratory mouse and provide the basis for establishment of a standard detection method for MNV.MethodsSpecific primers were designed and MNV DNA standards were prepared according to the MNV genome sequences published on NCBI.The specificity，sensitivity，repeatability and stability of the established Q-PCR method were tested.The established Q-PCR method was applied to detect 766 mouse caecum content samples to explore preliminarily the infection status of laboratory mice in Beijing.ResultsNo cross reaction showed in human norovirus and feline calicivirus with the established Q-PCR method.The sensitivity was up to 10 copies/μL.The coefficient of variation (CV)of intra-assay and inter-assay was less than 2%.There were 301 positive cases detected in the 766 samples of laboratory mice.ConclusionsThe established FQ-PCR method is accurate and effective with high specificity，sensitivity and repeatabiliy in the quantitative detetion of nucleic acid，and can be applied to rapidly and quantitatively screen MNV in laboratory mice.

R-33

A

1671-7856(2016)12-0070-07

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.12.014

2016-06-16

國家科技支撐課題(2013BAK11B01)。

高潔(1990-)，女，碩士，研究方向:實驗動物病毒學，E-mail:gaojieru@163.com。

賀爭鳴(1957-)，男，研究員，博士，研究方向:實驗動物微生物學，E-mail:hezm@nifdc.org.cn。