自發性肝硬化比格犬肝臟病理形態學研究

胡建廷，邱 波，英 永，屈卉錦，王鳳乾，張 鑫

(山東省藥學科學院、山東省化學藥物重點實驗室，濟南 250101)

自發性肝硬化比格犬肝臟病理形態學研究

胡建廷，邱 波，英 永，屈卉錦，王鳳乾，張 鑫

(山東省藥學科學院、山東省化學藥物重點實驗室，濟南 250101)

目的研究自發性肝硬化比格犬肝臟的病理形態學改變和血清生化改變，以建立適用于GLP的實驗動物背景資料。方法下肢靜脈采血制備血清，全自動生化分析儀測 ALT、AST、TP、ALB、ALP、TBIL、TC、TG、GGT等肝功能指標，比較患病動物與同期空白對照組動物上述指標的差異;對比格犬肝臟進行組織病理學檢查，光學顯微鏡下描述其病理形態學特點。結果與同期空白對照組動物相比，患病動物ALT、AST、ALP、TBIL、GGT顯著升高，ALB顯著降低;與正常組織相比，肝硬化的肝細胞呈結節狀再生、排列紊亂，形成數量不等的假小葉，假小葉周圍被增生的膠原纖維所包裹。結論需加強比格犬自發病變的病理監測，為藥物安全性評價提供實驗動物的背景資料。

比格犬;肝硬化;病理形態學

在重復給藥毒性試驗研究中，比格犬是常用的非嚙齒類實驗動物。關于比格犬的自發性病變，此前國內外學者也進行了相關研究了［1-3］，但未見有比格犬自發性肝硬化的文獻報道。本文以藥物非臨床安全性評價研究中空白對照組出現的一例肝硬化比格犬為研究對象，探討其肝臟生化指標的改變和肝臟病理形態學改變，以期為藥物非臨床安全性評價提供重要的病理學背景資料。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與飼養環境

普通級比格犬，購自北京瑪斯生物技術有限公司【SCXK(京)2011-0003】。動物飼養于本中心屏障環境(普通級)動物房【SYXK(魯)2010-0004】。

試驗開始時所有動物體重、攝食量及生化指標均無明顯差異。解剖前35 d，患病動物開始出現消瘦、體重減輕、皮膚粘膜輕度黃染等體征。患病動物為雌性，解剖時體重10 kg，24月齡。

1.2 儀器與試劑

日立7180全自動生化分析儀，由日立公司生產;櫻花VIP6全自動脫水機、全自動染色封片機等病理設備均由櫻花醫療株式會社生產。

肝功能生化檢測試劑盒均由寧波瑞源生物科技有限公司生產;Masson三色染色試劑盒由 Sigma公司生產，產品批號:SLBK9565V;網狀纖維染色試劑盒由北京索萊寶科技有限公司生產，產品批號:20160512。

1.3 方法

1.3.1 血清制備及肝生化指標檢測:下肢靜脈采血2～3 mL置促凝管中靜置30 min，3500 r/min離心10 min制備血清。全自動生化分析儀測定 ALT、AST、TP、ALB、ALP、TBIL、TC、TG、GGT等肝功能指標，比較患病動物與同期空白對照組動物上述指標的差異。

1.3.2 動物剖檢:剖檢前動物隔夜禁食不禁水。戊巴比妥鈉麻醉，頸動脈放血處死。打開腹腔，觀察患病動物腹腔內有無腹水、腹水的顏色和腹水量;肉眼觀察肝臟形態學改變。肝臟經粗切后放入中性甲醛溶液中固定。

1.3.3 組織病理學檢查:對肝組織進行常規取材、脫水、包埋、石蠟切片，根據說明書步驟進行HE染色、網狀纖維染色［4］和 Masson染色［5］，光學顯微鏡下觀察患病動物肝臟病理形態學改變。

2 結果

2.1 生化指標的改變

與同期空白對照組動物相比，患病動物 ALT、AST、ALP、TBIL、GGT顯著升高，ALB顯著降低，升高或降低幅度為同期空白對照組2～5倍不等;與同期空白對照組動物相比，患病動物TP、TC、TG未見明顯變化(表1)。

2.2 肉眼形態學觀察

患病動物腹腔內可見淡黃色腹水，腹水量約50 mL;患病動物肝臟形狀不規則、質地變硬，表面可見大小不一的顆粒狀結節和黃色壞死灶突出于肝臟表面(圖1)。

2.3 組織病理學檢查

HE染色顯示患病動物肝臟肝細胞呈彌漫性變性、壞死伴結節狀再生;再生的肝細胞排列紊亂，形成數量不等的假小葉，假小葉內中央靜脈缺如或偏位;肝內膽汁淤積(圖2、圖3)。

Masson染色顯示形成的假小葉被藍染的增生的膠原纖維分割、包裹;肝臟匯管區膠原纖維增生(圖4、圖5)。

網狀纖維染色顯示肝細胞壞死區域和假小葉周圍未見黑色網狀纖維塌陷或沉積，僅見棕黃色膠原纖維增生(圖6)。

表1 比格犬血清生化值改變Tab.1 Changes of serum biochemistry values in the Beagle dogs

圖1 肝臟表面形狀不規則、質地變硬，表面可見大小不一的顆粒狀結節和黃色壞死灶。圖2 肝細胞變性、壞死、結節狀再生。再生肝細胞排列紊亂，形成假小葉。假小葉中央靜脈缺如或偏位(HE，標尺=100μm，100×)。圖3 肝細胞廣泛壞死、膽汁淤積(HE，標尺=100μm，200×)。圖4 肝細胞結節狀再生。再生肝細胞排列紊亂，形成假小葉，假小葉中央靜脈缺如或偏位。假小葉被藍染的膠原纖維分割、包裹(Masson，標尺=100μm，40×)。圖5 匯管區膠原纖維增生(Masson，標尺=100μm，100×)。圖6 假小葉被棕黃色的膠原纖維分割、包裹;肝細胞壞死區和假小葉周圍未見黑色網狀纖維沉積(網狀纖維染色，標尺=100μm，40×)。Fig.1 The liver has irregular surface and hard constance，granular nodules and necrotic foci can be seen on the liver surface.Fig.2 Liver cellsdegeneration，necrosis and nodular regeneration.Disarrenged regenerative hepatocytes and pseudolobule formation.Central vein is absent in some pseudolobules.(HE，Bar=100μm，100×).Fig.3 Necrosis of hepatocytes and cholestasis(HE，Bar=100μm，200×)Fig.4 Disarranged regenerative hepatocytes and formation of hepatic pseudolobules.Extensive depositsofcollagen fibers in the pseudonudules. The central vein is absent in some pseudolobules.(Masson，Bar=100μm，40×).Fig.5 Hyperplasia of collagen fibers in the pirtal area.(Masson，Bar=100μm，10×)Fig.6 The pseudolobules were surrounded and separated by bundles of brown colored collagen fibers. No black colored reticular fibers were seen.(Reticular fiber Bar=100μm，40×)

3 討論

重復給藥毒性試驗中，肝臟是常見的毒性靶器官。為了對藥物相關性肝病和自發性病變進行正確鑒別，需加強對實驗動物自發性肝臟病變的研究。因此，本試驗系統描述了自發性肝硬化比格犬肝臟肉眼形態學、組織病理學變化特征以及血清生化指標改變。

肉眼形態學觀察結果顯示患病動物腹腔內出現約50 mL淡黃色腹水;病變肝臟形狀不規則、質地變硬，表面可見大小不一的顆粒狀結節突出于肝臟表面。組織病理學檢查結果顯示患病肝臟肝細胞呈彌漫性變性、壞死伴結節狀再生，再生的肝細胞排列紊亂，形成數量不等的假小葉，假小葉被增生的膠原纖維所分割、包裹，假小葉內中央靜脈缺如或偏位。肝臟匯管區膠原纖維增生，肝內膽汁淤積。上述結果提示，患病動物出現的肝臟病變為結節性肝硬化。結節性肝硬化可通過網狀纖維染色與亞急性肝衰竭進行鑒別診斷，亞急性肝衰竭時肝細胞壞死區域和假小葉周圍可見網狀纖維塌陷或沉積［6］。

生化檢測結果顯示肝硬化動物ALT、AST、ALP、TBIL、GGT顯著升高，ALB顯著降低。試驗中指標升高的意義與病理學檢查結果相一致，如ALT、AST顯著升高提示了肝細胞存在廣泛的變性、壞死。生化檢測結果同時也解釋了肝硬化動物出現的一些特殊體征，如動物出現明顯腹水是由于肝臟合成蛋白能力下降［7］，血中ALB顯著降低引起低蛋白血癥所致;動物出現皮膚粘膜黃染是由于膽紅素代謝障礙、肝內膽汁淤積，血中TBIL顯著升高所致。

肝硬化是一種慢性進行性疾病，病毒性肝炎、化學藥物、營養不良、中毒等因素均可導致肝硬化的發生。研究表明，肝硬化病理過程起始于肝內星狀細胞活化［8］。肝星狀細胞是存在于肝臟的一類特殊的間質細胞，主要位于肝血竇內皮與肝細胞之間的竇周隙內。活化后的肝星狀細胞可轉變為成纖維細胞，進而使肝臟細胞外基質及膠原纖維合成增多，引起細胞外基質發生重構形成纖維間隔［9-10］，導致肝臟假小葉被分割、包裹，最終形成肝硬化。

［1］Michael J，Goedken，RoyL，et al.Spontaneous and age-related testicular findings in beagle dogs［J］.Toxicologic Pathology，2008，36(3):465-471.

［2］MorishimaH，NonoyamaT，SasakiT，et al.Spontaneous lesions in beagle dogs used in toxicity studies［J］.Exp Anim，1990，39 (2):239-241.

［3］胡建廷，英永，王韶艷，等.比格犬垂體囊腫的組織病理學研究［J］.中國比較醫學雜志，2011，21(8):61-62.

［4］王曉燕，高俊巖，王艷霞.網狀纖維染色在臨床病理診斷中的應用及技術［J］.中國醫藥導報，2016，13(9):72-75.

［5］李敏，姚梅宏，曾玲，等.PASM-Masson染色法在腎穿刺活檢特殊染色中的應用與體會［J］.臨床與實驗病理學雜志，2014，30(6):693.

［6］雷揚，陶艷艷，劉成海.痰熱清注射液對急性肝衰竭小鼠的保護作用研究［J］.上海中醫藥大學學報，2015，29(4):51 -56.

［7］秦克芝，周華實.肝病診斷中八項生化指標的意義及臨床評價［J］.中國現代醫藥，2010，17(11):66.

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Study on pathomorphological changes of the Iiver in Beagle Dog with spontaneous hepatocirrhosis

HU Jian-ting，QIU Bo，YING Yong，QU Hui-jin，WANG Feng-qian，ZHANG Xin
(Shandong Pharmaceutical Academy，Shandong Provincial Key Laboratory Of Chemical Drug，Shandong Jinan 250101，China)

ObjectiveTo study the liver pathomorphological and serum biochemical changes in Beagle dog with spontaneous hepatocirrhosis and establish the backgroud information of experimental animals for GLP.MethodsThe ALT，AST，TP，ALB，ALP，TBIL，TC，TG and GGT were detected using an automatic biochemical analyzer，and compared the differences of above index between blank control and diseased animal.The histological changes of the liver were observed by optical microscopy.ResultsCompared with the blank control，the ALT，AST，ALP，TBIL and GGT of diseased dogs were increased significantly，and the ALB decreased significantly.Compared with normal dogs，the liver cells had nodular regeneration，arranged irregularly and pseudolobule formation.The pseudolobules were packaged with collagen fibers. Conclusion It is suggested that spontaneous lesions in Beagle dogs should be monitored so as to provide appropriate experimental animal histopathologicalbackgroud information for drug safety evaluation.

Beagle dog;Hepatocirrhosis;Pathomorphology

R-332

A

1671-7856(2016)12-0055-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.12.011

2016-07-12

2014年省自主創新及成果轉化專項計劃(2014ZZCX02104)。

胡建廷(1979-)，男，副主任藥師，研究方向:毒性病理，E-mail:jiantinghu@163.com。