肝癌治療新靶點GPC3研究進展

夏麗潔,張富春

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046)

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肝癌治療新靶點GPC3研究進展

夏麗潔,張富春

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046)

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3, GPC3)在調控細胞生長和分化方面起重要作用,與肝癌的發生、發展密切相關。GPC3在肝癌組織中特異性高表達，從而提示GPC3對肝癌診斷具有明顯的靈敏性和特異性，可作為肝癌治療的新靶點。該文綜述GPC3的結構功能及基于GPC3靶點的肝癌免疫治療進展，并討論其作為未來肝癌治療靶點的前景。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；肝細胞癌；抗腫瘤；腫瘤標志物；免疫治療；靶點

肝癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅著人類的健康[1]。在中國，由于存在較為嚴重的乙型肝炎病毒(HBV)感染等致癌風險因素，肝癌的發病率和死亡率態勢尤為嚴峻。肝癌的治療手段主要包括肝移植、腫瘤切除及非切除性局部療法如肝動脈化療栓塞等[2]。由于肝癌特別是肝細胞肝癌(HCC)早期易發生轉移以及治療后易復發[3]，因此，尋找一個可以準確判斷預后的指標和有效的肝癌治療靶點具有重要意義。本文就磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3, GPC3)在肝癌中的最新研究進展作一綜述。

1 GPC3的分子結構

GPC3是在研究過度生長綜合癥(Simpson-Golabi-Behmel syndrome，SGBS)時發現的蛋白聚糖家族成員[4]。GPC3基因位于人X染色體上(Xq26.1)。它的啟動子區包括6個SPI結構、7個AP2結構和2個CAAT盒，產生2 130 bp的轉錄子，編碼含580個氨基酸殘基的GPC3蛋白質前體。GPC3核心蛋白相對分子質量約為70 ku，它富含一段包括14個半胱氨酸殘基的獨特序列，中間為furin蛋白酶切位點。Furin蛋白酶裂解Arg358和Cys359形成40 ku的N末端亞基和30 ku的C末端亞基[5]。在N末端有一種分泌型信號蛋白，C末端通過與糖基磷脂酰肌醇共價結合而錨定于細胞膜上，且硫酸乙酰肝素鏈插入點的位置均由C端最末50個氨基酸所決定，使該鏈靠近細胞膜[6]。

2 GPC3與肝癌

2.1 GPC3在肝癌中的表達 GPC3在調控細胞生長和分化方面起重要作用,與原發性肝癌的發生、發展密切相關[7]。研究表明，GPC3在HCC高度表達，而在成人正常組織不表達或低水平表達[8]，提示GPC3對肝癌診斷具有明顯的靈敏性和特異性，可作為識別HCC特異性腫瘤標志物。Hsu等[9]通過對成對的HCC和非肝癌樣品進行mRNA差異檢測，發現有9～14個肝癌樣本中GPC3 mRNA高表達，而在8個非肝癌樣本中一個也沒有檢測到。此肝癌特異性進一步被證實通過Northern印跡分析數量有所增加的HCC樣本，胎兒和成人正常組織，以及成人其他類型的腫瘤。來自191例患者中有143例(74.8%)的原發性和復發性肝癌樣本GPC3呈現陽性，而另外154例中只有5例(3.2%)的非肝癌樣本中檢測到GPC3 mRNA的表達。GPC3與另一既定肝癌標志物甲胎蛋白(AFP)比較，根據113例原發性肝癌的分析表明，GPC3 mRNA表達的頻率高于血清中AFP水平(71.7%vs51.3%)。當腫瘤大小低于3 cm時，其差異甚至更明顯。

通過使用Northern blot和原位雜交技術，發現GPC3 mRNA在正常肝組織、肝臟局灶性結節增生和肝硬化中是低表達或不表達。與此相反，GPC3 mRNA表達在30個HCC樣本中有20個樣本明顯增加，并且在30個肝癌樣本中有5個適度增加。與正常肝組織相比較，在肝癌中GPC3表達的平均增幅為21.7倍，與局灶性結節性增生(FNH)或肝硬化比較，表達增幅分別為7.2倍和10.8倍[8]。通過使用免疫組化染色和ELISA方法，發現GPC3在HCC過表達占72%(21/29)，并且53% (18/34)的HCC患者的血清中GPC3水平有所提高(151～2 924 μg·L-1)，但是健康人中無法檢測到它[10]。

此后，越來越多的研究表明GPC3可用于HCC常規組織檢查和潛在治療靶點。Yamauchi等[11]開發的另外2個GPC3單克隆抗體GPC3-C02和A1836A，應用GPC3-免疫組織化學對良性和惡性肝癌病變進行病理學診斷。廣泛的GPC3陽性染色用于觀察肝母細胞癌和惡性肝細胞癌(47/56，84%)，GPC3的表達獨立于HCC的分化和大小[11]。

Baumhoer等[12]使用組織芯片免疫組化技術研究4 387個來自139個腫瘤類別和36個非腫瘤和腫瘤出現前組織類型的組織樣品。在非腫瘤性肝臟樣本中，9.2%的GPC3表達被檢測到(11/119)，癌前結節狀肝臟病變GPC3占16%(6/38)，HCC中GPC3占63.6%(140/220)，表明GPC3可以區分非腫瘤和癌前肝病毒的HCC。此外，其他一些腫瘤也顯示GPC3的表達，包括肺癌、鱗狀細胞癌、睪丸非精原細胞瘤和脂肪肉瘤。

2.2 GPC3作為血清標記物 雖然GPC3是一種細胞表面標記物，由于其可從細胞表面釋放到血清，可溶性GPC3可作為血清GPC3(sGPC3)被檢測[13]。因此，sGPC3水平可間接評估GPC3在肝癌組織中的表達水平[14]。比較3種血清標志物的表達水平，GPC3、人宮頸癌癌基因(HCCR)和AFP蛋白，用于189個樣本肝癌診斷(101例肝癌、40例肝硬化、18例肝炎和30例健康者)。結果發現，GPC3是最好的標記物。肝癌診斷使用26.8 μg·L-1為界限，GPC3有51.5%的敏感性和92.8%的特異性。HCCR達到了22.8%的敏感性和90.9%的特異性，如果界限設定為58.8 MAU·mL-1，使用199.3 μg·L-1為界限時，AFP的療效和敏感性分別為36.6%和98.5%。在這3個標記之間沒有明顯相關性。3個標記物同時檢測的靈敏度明顯增加至80.2%，比單獨檢測AFP檢出率高[15]。測量1 037例受試者(包括155例 HCC患者、180例慢性肝炎、124例肝硬化、442例非肝癌癌癥和136例健康對照)血清中GPC3的表達，顯示sGPC3平均水平在肝癌患者為(99.94±267.2) μg·L-1，明顯高于慢性肝炎患者(10.45±46.02) μg·L-1、肝硬化患者(19.44±50.88) μg·L-1、非肝癌患者(20.50±98.33) μg·L-1和健康對照(4.14±31.65) μg·L-1[14]。除了全長GPC3，GPC3的N端部分(GPC3N)也可被切割并分泌到血清中，因此GPC3N片段也可作為血清學標志物。然而，GPC3N片段的血清水平在HCC與肝硬化和健康對照相比，全長蛋白質的檢測值明顯降低[16]。

2.3 GPC3在組織病理學診斷過程中的作用 GPC3在組織病理學診斷過程中也可作為輔助工具，以區分HCC和肝硬化，發育異常的小瘤和局灶性結節增生樣結節。使用免疫組織化學和實時逆轉錄酶聚合酶鏈式反應研究59例直徑小于或等于3 cm的肝癌患者，以及66例肝硬化患者和16例低級別發育異常結節患者，33例高級別異型增生結節和13例局灶性結節性增生樣結節患者。結果發現，GPC3的表達在小肝癌中明顯比肝硬化和其他類型的小局灶性病變高，這表明從預惡性病變到小肝癌的轉變與GPC3的表達在大多數情況下急劇增加有關[17]。

Coston等[10]研究了107例肝癌、19例肝腺瘤(HA)、16例FNH和225例非人類肝臟腫瘤上皮細胞分化GPC3和CD34的表達。107例的肝癌中，94例表現為局灶性或彌漫性胞質GPC3染色，而所有HA和FNH的GPC3呈現陰性，225例非人類肝臟腫瘤上皮細胞只有7例差異表達GPC3。該數據表明，GPC3不僅來自非腫瘤肝上皮分化的差異化HCC，也是HA和FNH 的差異化HCC的一個非常特殊的標記物。在HCC中GPC3的表達與腫瘤的大小、分化或所處階段，肝硬化背景存在或不存在，或與底層的病因不相關。許多其它研究同樣表明GPC3在HCC高度特異性表達占70%～100 %，并且可以作為一個指標區分良性肝組織和肝癌[18]。

3 GPC3通過刺激致癌信號通路促進肝癌的生長

GPC3最初發現于SGBS綜合征，一種罕見的X連鎖過度生長疾病，其通過功能喪失的突變而引起。GPC3缺陷小鼠顯示發育的過度生長和一些典型的SGBS異常。在轉基因小鼠中，GPC3的過度表達抑制肝細胞增殖和肝再生[4]。

在細胞水平上，GPC3可用作共同受體或存儲多種生長因子，包括Wnts、Hedge-hogs、成纖維細胞生長因子和骨有關形態發生蛋白，調節這些生長因子與它們的細胞表面受體的相互作用[19]。研究表明，細胞表面GPC3促進肝癌細胞的生長。慢病毒感染的肝癌細胞表達可溶型GPC3(分泌形式缺少GPI錨定結構域)具有較低的細胞增殖率，通過受感染的細胞分泌的可溶型GPC3蛋白可以通過與內源性細胞表面的GPC3競爭結合抑制細胞增殖[20]。此外，在肝癌細胞株HepG2、Hep3B、Huh-7和Huh-4中通過siRNA或shRNA沉默GPC3基因能抑制肝癌細胞增殖[21]。

最近的一項研究表明，GPC3的高表達可通過ERK激活促進肝癌細胞上皮間質轉化(EMT)，EMT參與癌細胞的表型轉移和藥物耐受[22]。癌基因c-myc也可能有助于推測GPC3誘發惡性表型。在GPC3基因啟動子區發現c-myc結合位點，c-myc的結合直接激活GPC3基因的轉錄。同時，GPC3也上調c-myc基因的表達，在肝癌細胞中c-myc基因和GPC3最終形成一個正反饋信號回路[23]。

4 靶向GPC3的免疫治療

HCC是一種惡性程度高的腫瘤，許多研究人員正在尋找新的治療這種致病性疾病的方法。迄今為止，多種抗GPC3的單克隆抗體已經研制，這些抗體可以在細胞和組織中特異識別GPC3蛋白，抑制肝癌細胞的增殖或誘導凋亡[19,24-25]。

人源化抗GPC3單克隆抗體GC33，識別GPC3肽的C端，作為單一藥劑，已通過晚期或轉移性肝癌I期臨床試驗[26]。GC33的作用機制是抗體依賴細胞毒性(ADCC)，以及GC33能帶來細胞毒性浸潤T淋巴細胞進入腫瘤組織。靶向GPC3的人重鏈可變區(VH)抗體(HN3)對腫瘤細胞的GPC3核心蛋白具有高親和力，它既可結合GPC3的N端域，也可結合C端域，并獨立于GPC3的HS鏈。HN3可抑制多種肝癌細胞模型生長，對肝癌移植瘤裸鼠也表現出明顯的腫瘤生長抑制作用。HN3抑制肝癌細胞的增殖主要依賴于GPC3的功能性抗原表位[27]。通過GPC3肽(AA 510-560)免疫接種小鼠，通過流式細胞儀高通量組合篩選獲得抗體YP7。YP7對GPC3具有皮摩爾級的親和力，在進行免疫組化和蛋白印跡方面比商業抗體1G12更敏感。YP7在體內具有抗腫瘤活性，在體內腫瘤成像及抗體治療方面具有巨大潛力[28]。

5 結論與展望

多激酶抑制劑索拉菲尼的問世，開啟了肝癌分子靶向治療的新時代[29]。然而，腫瘤信號傳導是一個復雜、多因素、多途經和交叉對話的網絡系統，阻斷特異性的靶標可能會被其他異常分子克服而使腫瘤對該藥物產生耐藥性[30]。基于基因敲除和siRNA實驗結果，GPC3并不是肝癌細胞的致死基因。因此，是否抗GPC3抗體可導致腫瘤完全消退還需進一步研究。現有研究表明GC33和HN3靶向抗體不能完全消除腫瘤，因此單獨的抗體治療不能足夠有效地治愈肝癌。克服這個問題的措施包括與化療藥物(例如，索拉非尼已被批準用于HCC)相結合、改造抗體(如抗體-藥物偶聯物)、雙特異性抗體(例如，抗GPC3/抗CD3)、嵌合抗原受體的T細胞治療等。另一個問題是抗體治療后GPC3表達的穩定性。治療后存活的細胞可能會喪失GPC3的表達來獲得耐藥性。為了解決這個問題，未來對GPC3表達調控的研究是非常必要的。

GPC3有望成為治療肝癌的新靶點，但是它的結構-功能關系尚不明確。因此，進一步研究與探討GPC3的結構和功能將有助于發現新的更有效的具有腫瘤抑制活性的抗體，并在此基礎上應用多靶點抑制劑或聯合不同作用途徑和機制的藥物可能在未來肝癌治療中取得更大的成功，也為開發更加有效的肝癌治療藥物和合理的治療策略提供理論依據。

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Research progress of a new therapeutic target in hepatocellular carcinoma glypican-3

XIA Li-jie,ZHANG Fu-chun

(XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering,CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

Glypican-3(GPC3) plays very important role in the regulation of cell growth and differentiation in hepatocellular carcinoma(HCC).GPC3 is closely related to the occurrence and development of HCC. A dramatic elevation of GPC3 expression has been reported in a large proportion of HCC, which suggests that GPC3 is remarkably sensitive and specific to the diagnosis of HCC. GPC3 is a potential therapeutic target of HCC. This paper reviews the structure and function of GPC3, the progress of immunotherapy based on GPC3 of HCC, and discusses the prospect of therapeutic target of liver cancer in the future.

glypican 3; hepatocellular carcinoma; antitumor;tumor marker; immunotherapy; target

2016-07-09,

2016-08-13

國家自然科學基金資助項目(No 31500752)；新疆大學博士啟動基金資助項目(No BS150241)

夏麗潔(1985-),女,博士,講師,研究方向:分子免疫學,E-mail:xialijie1219@163.com;

張富春(1962-),男,博士,教授,博士生導師,研究方向:分子免疫學,通訊作者,E-mail: zfcxju@xju.edu.cn

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.004.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.002

A

1001-1978(2016)11-1486-04

R-05；R343.9；R344.5；R735.705；R977.6