胞外酸化對大鼠關節軟骨細胞焦亡的影響及可能機制

吳小山，陳飛虎，葛金芳，周仁鵬，祖勝芹，朱傳君

(安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥 230032)

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胞外酸化對大鼠關節軟骨細胞焦亡的影響及可能機制

吳小山，陳飛虎，葛金芳，周仁鵬，祖勝芹，朱傳君

(安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥 230032)

目的 觀察胞外酸化對大鼠關節軟骨細胞焦亡的影響，研究該過程中可能機制。方法 利用酶消化法獲得原代大鼠關節軟骨細胞。軟骨細胞分為不同pH處理組(pH 7.4、pH 7.0、pH 6.5和pH 6.0)以及pH6.0酸化不同時間組(0、6、12、24、48 h)，經ROS還原劑NAC預處理的酸化組和正常組，Real-time PCR和Western blot觀察各組促炎細胞因子IL-1β、IL-18和炎癥小體組成成分ASC、NLRP3、caspase-1基因和蛋白的表達情況，ELISA檢測各組細胞培養基中的IL-1β、IL-18含量，AO/ EB染色和LDH細胞毒性檢測試劑盒分析細胞的死亡情況，ROS測定試劑盒觀察細胞內ROS熒光強弱。結果 與pH 7.4組比較，酸化組的促炎細胞因子IL-1β、IL-18和炎癥小體組成成分ASC、NLRP3、caspase-1基因和蛋白的表達明顯增加，熒光顯微鏡觀察到ROS熒光明顯增強，AO/ EB染色和LDH檢測實驗發現酸化可以誘導軟骨細胞死亡，且pH 6.0酸化處理組效果最明顯；ROS還原劑NAC預處理可以明顯下調IL-1β、IL-18、ASC、NLRP3、caspase-1基因和蛋白的表達，并且明顯減弱軟骨細胞內ROS熒光，同時明顯下調細胞死亡率。結論 胞外酸化可能通過上調細胞內ROS的含量，促使軟骨細胞發生焦亡。

關節炎；關節軟骨細胞；細胞焦亡；炎癥小體；ROS；NAC

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種難治性多系統的免疫性疾病，累及患者的外周關節，具有較高的致殘、致畸性，對人類的健康危害很大[1]。研究表明，關節腔內炎性代謝物聚集導致的關節液pH值下降(可降至6.0及以下)是RA發病的主要原因之一，可導致軟骨細胞過度凋亡，最終引起關節軟骨及骨質的侵蝕與破壞等病理學改變[2]。同時，研究還發現促炎細胞因子IL-1β、IL-6、IL-18等在RA關節軟骨破壞和軟骨細胞凋亡過程中起著至關重要的作用[3]。

細胞焦亡(pyroptosis)是在2001年由Cookson等[4]研究發現的一種炎癥性程序性細胞死亡方式。其典型特征為密切依賴于caspase-1/11的激活，并伴隨著大量促炎細胞因子IL-1β、IL-18的釋放[5]。細胞焦亡在細胞的形態學特征以及調控機制上均不同于自噬、凋亡和壞死等細胞死亡方式。壞死的特征包括細胞核破碎、溶解，細胞膜的通透性增加，細胞內成分被釋放到細胞外組織中，引起局部強烈炎癥反應。凋亡也是一種程序性細胞死亡過程，形態學特征為細胞皺縮、核斷裂，繼而形成凋亡小體。由于凋亡細胞細胞膜的完整性沒有破壞，細胞內成分沒有被釋放到細胞外，所以很少引起周圍組織的炎癥反應。研究表明，焦亡細胞在形態上同時具有凋亡和壞死的特征，同時焦亡細胞的細胞膜也遭到破壞，細胞內乳酸脫氫酶(LDH)被釋放到細胞外。

炎癥小體(inflammasome)是存在于細胞質中的一種具有廣泛活性的輪狀結構體，它能激活半胱天冬酶1 (caspase-1)，后者進一步促進促炎細胞因子IL-1β、IL-18切割和成熟，并且可以促使細胞發生焦亡[6]。炎癥小體主要由受體蛋白(receptor protein)、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing CARD,ASC)和效應分子前半胱天冬酶1(pro-caspase-1)3部分構成。文獻表明，細胞焦亡的發生與許多疾病的發生發展密切相關，例如細菌感染[7]、動脈粥樣硬化性疾病[8]、神經系統性疾病[9]。最近的研究發現，細胞焦亡與一些自身免疫性疾病，例如RA的發生有關[10-12]，提示細胞焦亡可能參與了RA的發生、發展過程。本課題組的前期研究結果表明，AA大鼠存在著關節軟骨細胞的凋亡，同時胞外酸化(pH 6.0)可以明顯誘導大鼠關節軟骨細胞凋亡[13]，并且存在著一定的pH依賴性。即在RA發生過程中，存在著關節軟骨細胞的死亡過程，并且關節液中含有大量的炎癥因子，這一點與細胞焦亡的特征相符，但是在RA發生過程中是否存在關節軟骨細胞焦亡，目前尚不清楚。

本研究將用胞外酸化過程模擬RA發生過程中關節軟骨細胞所處的微環境，以大鼠膝關節軟骨細胞為觀察對象，考察胞外酸化過程中是否存在關節軟骨細胞的焦亡及其部分機制。進一步闡明胞外酸化是否可以誘導關節軟骨細胞焦亡，及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SD大鼠，SPF級，♂，體質量140 g～180 g，安徽省實驗動物中心提供，動物合格證號：皖動準字01號。1.2 藥品與試劑 N-acetyl-L-cysteine(NAC,C5H9NO3S，分子量163.19，純度大于99%)、LDH檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒購自碧云天公司；抗caspase-1 p10 抗體、抗ASC抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；抗NLRP3抗體、抗β-actin抗體購自美國Biosynthesis公司；DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司；Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma 公司；胎血清(FBS)購自美國Gibco公司；大鼠IL-1β、IL-18酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒購自Elab Science。

1.3 原代大鼠關節軟骨細胞的分離、培養 依照本課題組常規操作方法分離原代大鼠膝關節關節軟骨細胞[14]。將原代軟骨細胞用培養基重懸，并接種在25 cm2透氣細胞培養瓶中，于恒溫培養箱(37℃、5% CO2)中培養，48 h后觀察貼壁情況并換液。以后每隔2～3 d換1次液，當細胞鋪滿培養瓶瓶底后進行傳代處理，選取3～4代的軟骨細胞進行后續實驗。

1.4 細胞分組及藥物處理 關節軟骨細胞按照如下分組：① pH 7.4正常組、pH 7.0酸化組、pH 6.5酸化組和pH 6.0酸化組，各組細胞分別用相應pH值的含1% FBS的培養基培養24 h，收集細胞，觀察酸化對細胞焦亡的影響；② pH 7.4正常組、pH 6.0酸化6 h組、酸化12 h組、酸化24 h組和酸化48 h組，處理相應時間后收集細胞，觀察酸化對細胞焦亡的影響；③ pH 7.4正常組、pH 6.0酸化組以及pH 6.0+NAC(10 mmol·L-1)處理組，細胞接受相應處理后，再用pH 6.0的培養基處理24 h，收集細胞，觀察NAC對胞外酸化誘導的細胞焦亡的影響。

1.5 熒光倒置顯微鏡觀察活性氧自由基(ROS)水平 細胞前處理過程依據“1.4”中分組情況，依據ROS檢測試劑盒說明書步驟處理細胞后，于熒光倒置顯微鏡下觀察DCF的熒光強度，并拍照。注：DCF的熒光光譜和FITC的熒光光譜非常相似。

1.6 乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒檢測培養基中LDH水平 細胞前處理過程依據“1.4”中分組情況，96孔板分成陰性對照孔、最大酶活性孔以及藥物處理孔，并做好標記。提前1 h在96孔細胞培養板“最大酶活性孔”中加入20 μL LDH釋放試劑，然后輕輕吹打，在培養箱中繼續培養。1h后，將96孔板用離心機離心(4℃、400×g、5 min)。轉移各孔中的上清液120 μL至1塊新的96孔板中，用全波長酶標儀在490 nm處檢測吸光度。

1.7 ELISA檢測細胞培養基中IL-1β、IL-18水平 細胞前處理過程依據“1.4”中分組情況，收集各處理組細胞的培養基，4℃、2 000 r·min-1離心20 min，收集上清液，于-80℃長期保存。按照大鼠IL-1β、IL-18檢測試劑盒說明書步驟，測定各組培養基上清中IL-1β、IL-18的濃度。

1.8 軟骨細胞焦亡水平檢測

1.8.1 AO/EB染色觀察軟骨細胞焦亡情況 AO/EB染料配制：AO、EB配成100 mg·L-1的儲備液，4℃保存，用前等量混合。軟骨細胞接種在無菌潔凈的蓋玻片上，細胞貼壁牢固給予相應處理后，用PBS緩沖液清洗2次，在蓋玻片上滴加1滴AO/EB染料工作液染色，15 s后，用熒光倒置顯微鏡觀察細胞焦亡發生情況并拍照。

1.8.2 Real-time PCR檢測軟骨細胞IL-1β、IL-18、ASC、NLRP3、caspase-1 mRNA表達 細胞前處理過程依據“1.4”中分組情況，用TRIzol裂解細胞并提取細胞內總RNA，使用核酸定量儀對各組細胞總RNA進行定量，以1 000 ng總RNA每體系(體系為10 μL)，按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄得到cDNA。Real-time PCR引物序列見Tab 1。反應總體系為10 μL，其中上、下游引物各0.3 μL，2×SYBR Green 5 μL，cDNA 0.5 μL，無酶水3.9 μL。

Tab 1 Primer sequences of several genes for real-time PCR

1.8.3 Western blot法檢測軟骨細胞ASC、NLRP3、caspase-1蛋白表達 細胞前處理過程依據“1.4”中分組情況，達到預定時間后，棄去原培養基,用RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白，使用熒光蛋白定量儀對各組細胞總蛋白進行定量。加5×SDS蛋白上樣緩沖液混合后，于100℃沸水變性10 min，-20℃冰箱保存。將等量的各組總蛋白電泳分離后，電轉膜到PVDF膜上。用相對應的一抗孵育過夜，接著用相應種屬的辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，然后用化學發光ECL顯影試劑盒對PVDF膜進行曝光、顯影、拍照。Image軟件分析蛋白顯影結果。

2 結果

2.1 胞外酸化對大鼠關節軟骨細胞焦亡的影響

2.1.1 胞外酸化對大鼠關節軟骨細胞ASC、NLRP3、cleaved caspase-1 蛋白表達的影響 由Fig 1 Western blot 結果可知，與pH 7.4的正常組細胞相比，pH 6.5和pH 6.0酸化組關節軟骨細胞ASC、NLRP3、cleaved caspase-1蛋白表達升高，且差異具有統計學意義(P<0.05或0.01)。由pH 6.0酸化不同時間的結果可以看出，隨著酸化時間的延長，ASC、NLRP3、cleaved caspase-1蛋白的表達上調(P<0.05或0.01)，且具有一定的時間依賴性。

2.1.2 胞外酸化對大鼠關節軟骨細胞IL-1β、IL-18、ASC、NLRP3、caspase-1 mRNA轉錄的影響 根據Fig 2 Real-time PCR的結果可知，與pH 7.4的正常組細胞比較，pH 6.5和pH 6.0酸化組關節軟骨細胞的ASC、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA轉錄升高，且差異具有統計學意義(P<0.05或0.01)。同時，由pH 6.0酸化不同時間的結果可以看出，隨著酸化時間的延長，ASC、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA轉錄明顯上調(P<0.05或0.01)。

2.2 胞外酸化對大鼠關節軟骨細胞培養基中IL-1β、IL-18蛋白表達的影響 根據Fig 3的結果可知，與pH 7.4的正常組細胞相比，pH 6.5和pH 6.0酸化明顯上調關節軟骨細胞的培養基中促炎細胞因子IL-1β、IL-18水平，且差異具有統計學意義(P<0.01)。同時，隨著pH 6.0酸化時間的延長，軟骨細胞的培養基中促炎細胞因子IL-1β、IL-18水平明顯升高(P<0.05或0.01)。

2.3 胞外酸化對大鼠關節軟骨細胞LDH釋放率的影響 根據Fig 4的結果可知，與pH 7.4的正常組細胞相比，pH 6.5和pH 6.0酸化明顯上調關節軟骨細胞LDH的釋放率，且差異具有統計學意義(P<0.01)。同時，隨著pH 6.0酸化時間的延長，軟骨細胞的培養基中LDH水平明顯升高(P<0.05或0.01)。

Fig 1 Effects of extracellular acidosis on protein expression of ASC, NLRP3, cleaved caspase-1(n=3)

Fig 2 Effects of extracellular acidosis on mRNA expression of ASC, NLRP3, caspase-1, IL-1β,IL-18(n=3)

*P<0.05,**P<0.01vspH 7.4 group

Fig 3 Effects of extracellular acidosis on expression of IL-1β, IL-18 in cultured supernatants(n=3)

*P<0.05,**P<0.01vspH 7.4 group

2.4 胞外酸化對大鼠關節軟骨細胞內ROS產生的影響 從Fig 5的熒光倒置顯微鏡拍照結果以及熒光定量結果可知，與pH 7.4的正常組細胞相比，pH 6.5和pH 6.0酸化組軟骨細胞內ROS綠色熒光明顯增強，說明酸化組軟骨細胞內ROS表達量明顯升高。

2.5 NAC對胞外酸化誘導的軟骨細胞ROS產生的影響 由Fig 6的熒光倒置顯微鏡拍照結果以及熒光定量結果可知，與pH 7.4的正常組細胞相比，pH 6.0酸化組軟骨細胞內ROS綠色熒光明顯增強，用ROS還原劑NAC(10 mmol·L-1)預處理可以明顯降低軟骨細胞內ROS水平。

Fig 4 Effects of extracellular acidosis on level of LDH in cultured supernatants(n=3)

*P<0.05,**P<0.01vspH 7.4 group

2.6 NAC對胞外酸化誘導的細胞焦亡的影響

2.6.1 NAC對胞外酸化誘導的軟骨細胞ASC、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18表達的影響 根據Fig 7的Western blot和Real-time PCR結果可知，與pH 7.4的正常組細胞相比，pH 6.0酸化組關節軟骨細胞的ASC、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18基因和蛋白表達明顯升高(P<0.05或0.01)，用ROS還原劑NAC(10 mmol·L-1)預處理可以明顯降低軟骨細胞ASC、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18基因和蛋白表達水平(P<0.05或0.01)。

2.6.2 AO/EB染色觀察NAC對胞外酸化誘導的軟骨細胞焦亡的影響 由Fig 8的熒光倒置顯微鏡拍照結果以及熒光定量結果可知，pH 7.4的正常組細胞死亡數較少，pH 6.0酸化組軟骨細胞被染成橘黃色，著色細胞比例增加，細胞死亡明顯增多，用NAC預處理可以明顯抑制軟骨細胞死亡。

2.7 NAC對胞外酸化誘導的軟骨細胞培養基中IL-1β、IL-18蛋白水平的影響 由Fig 9 ELISA檢測結果可知，與pH 7.4的正常組細胞相比，pH 6.0酸化組關節軟骨細胞培養基中促炎細胞因子IL-1β、IL-18含量明顯上調(P<0.05或0.01)，用NAC預處理可以明顯降低軟骨細胞培養基中促炎細胞因子IL-1β、IL-18水平。

Fig 5 Effects of extracellular acidosis on expression of ROS

A:pH 7.4 group;B:pH 7.0 group;C:pH 6.5 group;D:pH 6.0 group;E:Fluorescent quantitative results.*P<0.05,**P<0.01vspH 7.4 group

Fig 6 Effects of NAC on extracellular acidosis induced expression of ROS

A:pH 7.4 group;B:pH 6.0 group;C:pH 6.0+NAC group;D:Fluorescent quantitative results.**P<0.01vspH 7.4 group;##P<0.01vspH 6.0 group

Fig 7 Effects of NAC on extracellular acidosis induced expression of ASC, NLRP3, caspase-1, IL-1β, IL-18(n=3)

*P<0.05,**P<0.01vspH 7.4 group;#P<0.05,##P<0.01vspH 6.0 group

Fig 8 Effects of NAC on extracellular acidosis induced pyroptosis by AO/EB staining

A:pH 7.4 group;B:pH 6.0 group;C:pH 6.0+NAC group;D:Fluorescent quantitative results.**P<0.01vspH 7.4 group;##P<0.01vspH 6.0 group

Fig 9 Effects of NAC on extracellular acidosis induced expression of IL-1β, IL-18 in cultured supernatants(n=3)

*P<0.05,**P<0.01vspH 7.4 group;#P<0.05,##P<0.01vspH 6.0 group

2.8 NAC對胞外酸化誘導的軟骨細胞LDH釋放率的影響 由Fig 10 LDH細胞毒性檢測結果可知，與pH 7.4的正常組細胞相比，pH 6.0酸化組關節軟骨細胞培養基中LDH含量明顯上調(P<0.01)，用NAC預處理可以明顯降低軟骨細胞培養基中LDH水平，即用NAC預處理可以降低胞外酸化誘導的關節軟骨細胞的死亡率。

Fig 10 Effects of NAC on extracellular acidosis induced expression of LDH in cultured supernatants(n=3)

**P<0.01vspH 7.4 group;##P<0.01vspH 6.0 group

3 討論

細胞焦亡是高度依賴于caspase-1/11激活的一種炎癥性死亡方式[15]，它通過激活細胞內的多種多蛋白復合物炎癥小體，廣泛參與機體的先天性免疫和獲得性免疫系統抵抗微生物入侵的過程[16]。在病理狀態下，需要2個關鍵信號的激活才能促使細胞焦亡發生，以及促炎因子的釋放：信號1，外來刺激激活膜上的模式識別受體(PRRs)，促進細胞內炎癥小體組成成分ASC、NLRP3、caspase-1以及促炎細胞因子IL-1β、IL-18 基因的轉錄和蛋白的合成；信號 2，外部信號促進炎癥小體復合物的聚集和組裝，以及促炎細胞因子IL-1β、IL-18的剪切成熟[17-18]。研究表明，自然界的多種物質[19]都可以激活細胞焦亡信號通路，導致細胞焦亡的發生，例如多種細菌毒素、ATP、尿酸結晶、明礬、dsDNA、Ca2+、ROS以及氫離子[20]。

近年來的研究發現，細胞焦亡與RA的發生、發展過程密切相關。Kastbom等[10]研究發現，在瑞典人群的RA患者中存在NLRP3炎癥小體基因的多態性，同時Choulaki等[11]的研究也發現，RA患者的外周血細胞中NLRP3炎癥小體的表達量明顯增加。此外,研究還發現，用藥物A20阻斷NLRP3炎癥小體、抑制其聚集和激活對RA患者的關節有一定的保護作用[12]。綜合表明在RA中存在細胞焦亡，但具體機制有待研究證實。在RA中關節部位局部組織的高度酸化是造成RA患者關節軟骨侵蝕、骨質破壞的主要因素。Rajam?ki等[21]研究發現,胞外酸化通過促進人巨噬細胞NLRP3炎癥小體的聚集、組裝，從而促進其IL-1β的合成釋放。本課題組的前期研究也發現pH6.0酸化處理可以明顯誘導大鼠關節軟骨細胞凋亡[14]。但是在RA局部組織酸化的微環境中是否存在關節軟骨細胞的焦亡，尚不清楚。

本研究以原代大鼠關節軟骨細胞為研究對象，利用胞外酸化處理模擬軟骨細胞所處微環境，觀察大鼠關節軟骨細胞在用胞外酸化處理后是否發生焦亡。實驗結果表明，酸化處理后，關節軟骨細胞炎癥小體組成成分ASC、NLRP3、caspase-1、促炎細胞因子IL-1β、IL-18基因和蛋白的表達明顯增加，LDH細胞毒性檢測發現LDH的釋放率均明顯增加，說明酸化處理可以誘導關節軟骨細胞死亡。此外，細胞內ROS的表達量也明顯上調。以上結果提示胞外酸化刺激可以誘導關節軟骨細胞發生焦亡。

活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是細胞內的一種重要的第二信使分子，具有極為重要的生物學活性和功能，例如氧化應激、細胞分化以及細胞凋亡等，在多種疾病的發生、發展過程中發揮著重要的作用[22]。細胞內ROS主要來自于細胞線粒體的氧化磷酸化過程，在哺乳動物細胞中ROS也由一系列酶活性產生，例如NADPH氧化酶。研究表明，ROS參與NLRP3炎癥小體的激活過程[23]。研究發現，當單核細胞暴露于NLRP3炎癥小體激活因子的情況下，可以促使ROS的生成，從而進一步促進氧化還原依賴的轉錄因子如NF-κB和AP-1的激活，促進促炎細胞因子的產生。同時，體內研究還發現，IL-1β的合成和caspase-1的激活也依賴于ROS的產生。本實驗的研究結果表明，與pH 6.0酸化組比較，使用ROS還原劑NAC預處理可以明顯抑制細胞內ROS的表達，下調炎癥小體組成成分ASC、NLRP3、caspase-1、促炎細胞因子IL-1β、IL-18基因和蛋白的表達，降低LDH的釋放率，AO/EB染色發現NAC同時也可以抑制軟骨細胞的死亡。

綜上所述，本研究證實胞外酸化的微環境可以誘導關節軟骨細胞發生焦亡，促進軟骨細胞分泌促炎細胞因子IL-1β、IL-18，加重關節軟骨局部組織的侵蝕破壞和炎癥反應，并且這種誘導作用與胞外酸化促進軟骨細胞內ROS表達有關。提示RA的發生、發展很可能與關節軟骨細胞焦亡密切相關，為將來RA的治療提供了新方向。

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Effects of extracellular acidosis on pyroptosis of rat articular chondrocytes and its possible mechanisms

WU Xiao-shan,CHEN Fei-hu,GE Jin-fang,ZHOU Ren-peng,ZU Sheng-qin,ZHU Chuan-jun

(SchoolofPharmaceuticalSciences,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Aim To study the effects of extracellular acidosis on articular chondrocytes pyroptosis and its possible mechanisms.Methods Primary articular chondrocytes were incubated in different pH and NAC. The expression of proinflammatory cytokines IL-1β, IL-18, ASC, NLRP3, caspase-1 were detected by Western blot and real-time PCR. The state of pyroptosis was identified by AO/EB staining and LDH contents. The expression of ROS was observed by DCFH-DA, and ELISA was used to detect the IL-1β,IL-18 in cultured supernatants.Results Compared with the normal cell, extracellular acidosis could increase the expression of IL-1β, IL-18, ASC, NLRP3 and caspase-1, upregulate the fluorescence intensity of intercellular ROS, accompanied with the promoted release of LDH. Moreover, it is observed that extra-cellular acidosis could also induce chondrocytes death by AO/EB staining. NAC，the scavenger of ROS could inhibit these effects of extracellular acidosis on chondrocytes.Conclusion Extracellular acidosis may induce chondrocyte pyroptosis via upregulating the intracellular ROS content.

arthritis; articular chondrocytes; pyroptosis; inflammasome; ROS; NAC

2016-07-13,

2016-08-13

國家自然科學基金資助項目(No 81271949，30873080)

吳小山(1991-)，男，碩士生，研究方向：分子藥理學，E-mail:wxsahmu@sina.com；

陳飛虎(1962-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：抗炎免疫藥理學與分子藥理學，通訊作者，E-mail:cfhchina@sohu.com

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.022.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.011

A

1001-1978(2016)11-1531-09

R-332；R322.72；R329.25；R392.12；R593.22