縫隙連接蛋白43對人非小細胞肺癌HCC827細胞吉非替尼獲得性耐藥機制的初步研究

駱 敏, 羅燕妹, 覃貴慧,滕翠芳,王翰林,陽 潔

(廣西醫科大學 1. 藥學院藥理學教研室、2.臨床醫學院，廣西 南寧 530021)

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◇論 著◇

縫隙連接蛋白43對人非小細胞肺癌HCC827細胞吉非替尼獲得性耐藥機制的初步研究

駱 敏1, 羅燕妹1, 覃貴慧1,滕翠芳1,王翰林2,陽 潔1

(廣西醫科大學 1. 藥學院藥理學教研室、2.臨床醫學院，廣西 南寧 530021)

目的 探討縫隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)與非小細胞肺癌(NSCLC)細胞產生吉非替尼(Gefitinib)獲得性耐藥的關系。方法 在Gefitinib敏感細胞株HCC827上，通過逐步遞增Gefitinib濃度誘導獲得Gefitinib耐藥細胞株HCC827 GR；MTT法檢測Gefitinib對HCC827/GR細胞的IC50；RT-PCR檢測Cx43的mRNA水平；Western blot檢測Cx43和磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白水平；parachute熒光示蹤法檢測細胞縫隙連接功能(gap junction intercellular communication, GJIC)；免疫熒光技術檢測Cx43的細胞定位。結果 Gefitinib作用于HCC827和HCC827 GR的IC50分別為(0.07±0.019) μmol·L-1、(10.84±0.021) μmol·L-1(P<0.01)；HCC827 GR中Cx43的mRNA和蛋白水平較HCC827明顯降低(P<0.05)，但p-Akt蛋白水平明顯升高(P<0.05)。在HCC827 GR細胞上加PI3K的特異性抑制劑LY294002(25 μmol·L-1, 24 h)后，p-Akt蛋白水平明顯下降(P<0.01)，且Cx43的蛋白水平明顯升高(P<0.01)。HCC827及HCC827 GR均未檢測到GJIC，用GJIC增強劑RA(retinoic acid)處理(10 μmol·L-1, 24 h)上述細胞，亦未檢測到熒光傳遞，免疫熒光結果顯示Cx43表達在細胞胞質。結論 胞質中Cx43的下調可能促進NSCLC細胞對Gefitinib的獲得性耐藥，其機制可能與Cx43非GJIC依賴的PI3K/Akt信號通路激活有關。

非小細胞肺癌；縫隙連接蛋白43；吉非替尼；獲得性耐藥；PI3K/Akt；縫隙連接功能

吉非替尼(易瑞沙)是目前臨床最常用的一種選擇性表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)，適用于既往接受過化療或不適于手術的晚期或轉移性的非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)患者，但幾乎所有對吉非替尼治療有效的患者在一定時間的緩解期后會出現耐藥、復發的現象[1]，其機制尚不明確。

縫隙連接蛋白(connexins，Cxs)是一個多基因家族表達的保守蛋白，其組成的縫隙連接通信 (gap junction intercellular communication，GJIC)能連接溝通相鄰細胞胞質直接傳遞電、化學及代謝物質，調控同步細胞活動、細胞增殖與凋亡、器官發育等[2]，尤其與腫瘤化療耐藥密切相關。近年來發現，Cxs能獨立于GJIC在腫瘤發生、發展中發揮重要作用[3]。目前已知，Cxs有21個亞型，它們的表達具有一定的組織特異性，正常肺組織主要表達Cx26、Cx43[4]。最近我們的研究發現[5]，Cx26在吉非替尼耐藥細胞HCC827 GR中明顯升高，并且不依賴于GJIC，Cx26可與PI3K/Akt相互激活，從而誘導了NSCLC細胞EMT的發生，進而促進NSCLC對吉非替尼的耐藥性。非常有趣的是，另一個在肺部分布的重要Cx亞型Cx43，在HCC827 GR中的表達明顯降低，表現出與Cx26相反的變化。故本研究擬探索Cx43對NSCLC吉非替尼獲得性耐藥的影響，以闡明Cx43在NSCLC中吉非替尼獲得性耐藥的作用及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 NSCLC細胞系HCC827購自美國ATCC；RPMI 1640培養基、胎牛血清和胰酶購自美國Gibco公司；吉非替尼(易瑞沙)購自英國AstraZeneca公司；MTT、嘌呤霉素、蛋白質提取試劑及鼠抗人Cx43多克隆抗體購自美國Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Tiangen公司；兔抗人Cx43單克隆抗體購自Santa Cruz公司；兔抗人β-actin多克隆抗體、羊抗兔二抗、驢抗兔熒光二抗購自英國Abcam公司；兔抗人單克隆抗體Akt、兔抗人單克隆抗體 p-Akt(Ser473)購自美國CST公司；羊抗鼠二抗購自美國KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 人NSCLC細胞HCC827培養、構建吉非替尼誘導耐藥株HCC827 GR 人NSCLC細胞HCC827、HCC827 GR用含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養基于37 ℃、5% CO2培養箱中常規培養、傳代。在人NSCLC吉非替尼敏感細胞株HCC827的培養基中，按0.01、0.05、0.10、0.50、1.0 μmol·L-1濃度梯度逐步增加吉非替尼濃度，使用濃度為1.0 μmol·L-1的吉非替尼維持細胞耐藥性，以構建吉非替尼誘導耐藥株HCC827 GR。

1.2.2 MTT法檢測吉非替尼對細胞的半數抑制濃度(IC50) 取對數生長期的細胞以1×108·L-1的密度接種于96孔板，每孔100 μL，每組設3個復孔。吉非替尼以0.01、0.10、1.00、10.0、100.0 μmol·L-1濃度作用細胞，細胞培養96 h后，每孔加入0.5 mg·L-1的噻唑藍20 μL，4 h后吸棄培養液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床振蕩10 min后，用酶標儀在波長570 nm處檢測各孔吸光值(OD)，以吉非替尼濃度為橫坐標，OD570 nm為縱坐標，繪制曲線，求出IC50。

1.2.3 RT-PCR檢測細胞系中Cx43的表達情況 按照試劑說明書，從HCC827、HCC827 GR細胞提取總RNA并反轉錄成cDNA，RT-PCR檢測Cx43的mRNA表達水平。擴增Cx43及GAPDH的上游引物和下游引物分別為：5′-AGGAGTTCAATCACTTGGCG-3′(sense)和5′-GCAGGATTCGGAAAATGAAA-3′ (antisense)、5′-AGCCACATCGCTCAGACA-3′(sense)和5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′ (antisense)。反應條件為：95 ℃ 5 min; 94 ℃ 45 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 30個循環；72 ℃ 5 min。用2-ΔΔCt法計算各組的mRNA相對表達量。

1.2.4 Western blot檢測細胞系中Cx43和p-Akt的表達水平 根據我們之前報道過的方法[6]，收集各組細胞，加入1 mL預冷的RIPA裂解液(含1%PMSF)冰上裂解5 min，4 ℃、12 000×g離心30 min，取蛋白上清，用BCA蛋白定量試劑盒按照說明書嚴格操作，測定各組細胞株蛋白樣品濃度。將蛋白樣品20 μg經10%SDS-PAGE分離后轉移到NC膜上，經5%脫脂牛奶(TBST稀釋)室溫封閉1 h后，分別加入鼠抗人Cx43多克隆抗體(1 ∶500)、兔抗人Akt單克隆抗體(1 ∶1 000)、兔抗人p-Akt單克隆抗體(1 ∶1 000)，4 ℃過夜，兔抗人β-actin (1 ∶10 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌后，分別加入羊抗鼠二抗(1 ∶7 500)、羊抗兔二抗(1 ∶10 000)，PBST洗滌后，Bio Rad凝膠成像系統采集圖像，并以β-actin為內參對各細胞株Cx43及以Akt為內參對p-Akt條帶進行灰度分析。

1.2.5 Parachute熒光示蹤法檢測細胞GJIC 根據我們之前報道的方法[7]，將各組細胞分別與熒光指示劑calcine-AM共同孵育，使calcine-AM進入細胞，該細胞稱為“供體細胞”(donor cells)。再將donor cells接種到已生長融合至80%的相應組HCC827、HCC827 GR細胞(接受細胞，receiver cells)上，培養4 h。用GJ功能增強劑RA 10 μmol·L-1處理[8]相應組HCC827、HCC827 GR細胞，24 h后用PBS洗滌3次，將細胞分別與熒光指示劑calcine-AM共同孵育，并接種到相應的細胞上。待形成穩定的GJ后，小分子的calcine(發綠色熒光)就能通過GJ進入相鄰的receiver cells。用熒光顯微鏡觀察、計數1個donor cell周圍含有calcine的receiver cell數目，作為GJ功能的指標。

1.2.6 免疫熒光法檢測Cx43在細胞中的蛋白定位 根據我們之前報道的方法[5]，將細胞接種在蓋玻片上24 h后，冰甲醇固定10 min，2%牛血清白蛋白室溫封閉30 min，經兔抗人Cx43多克隆抗體(1 ∶50，PBS稀釋)4 ℃孵育過夜后，用驢抗兔熒光二抗(1 ∶200，PBS稀釋)于室溫孵育1 h，接著用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染。激光共聚焦掃描熒光顯微鏡(Nikon A1, Tokyo, Japan)采集成像，并用NIS-Elements軟件進行分析。

2 結果

2.1 構建人NSCLC吉非替尼誘導耐藥細胞株HCC827 GR 從細胞株的表型特點可以看出，通過吉非替尼誘導，HCC827細胞失去上皮細胞特性而獲得間質細胞特性，表現為由典型的上皮鵝卵石樣變成散在的、細長的成纖維細胞樣外形。MTT實驗結果顯示，HCC827的IC50值為(0.07±0.019) μmol·L-1(<1.0 μmol·L-1)，HCC827 GR的IC50值為(10.84±0.021) μmol·L-1(>10 μmol·L-1)。上述結果表明，吉非替尼誘導耐藥細胞株HCC827 GR已成功構建(Fig 1)。

2.2 RT-PCR和Western blot檢測Cx43的mRNA和蛋白表達水平 RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，HCC827 GR細胞中Cx43的mRNA表達量明顯低于HCC827細胞(P<0.05)，并且Western blot結果顯示，HCC827 GR細胞中的Cx43蛋白表達量也較HCC827細胞明顯降低(P<0.05)(Fig 2)。

Fig 1 Construction of gefitinib induced resistant HCC827 GR cells ±s,n=5)

A: The morphology of HCC827 and HCC827 GR cells; B: The gefitinib cytotoxicity in HCC827 and HCC827 GR cells.*P<0.05,**P<0.01vsparental group

2.3 Western blot檢測p-Akt、Akt的蛋白表達水平及加抑制劑LY294002后p-Akt、Cx43的蛋白表達水平 Western blot結果顯示，與親本細胞HCC827相比，HCC827 GR細胞中的p-Akt蛋白表達量明顯升高(P<0.05)。在HCC827 GR細胞上加PI3K的特異性抑制劑LY294002(25 μmol·L-1, 24 h)后，p-Akt蛋白水平明顯下降(P<0.01)，且Cx43的蛋白水平明顯升高(P<0.01)(Fig 3)。

2.4 Parachute熒光示蹤法檢測GJIC 為研究NSCLC細胞中Cx43組成的GJIC是否與吉非替尼獲得性耐藥有關，我們用parachute法檢測了HCC827、HCC827 GR的GJ功能。如Fig 4所示，以肺癌細胞NCI-H460作為陽性對照，在HCC827及HCC827 GR細胞中均未檢測到熒光傳遞。為排除是否有難以檢測到的GJIC存在，我們進一步用GJIC增強劑RA處理(10 μmol·L-1，24 h)上述細胞，亦未檢測到熒光傳遞。這些結果表明，HCC827、HCC827 GR細胞中GJIC均缺失。

2.5 免疫熒光法檢測Cx43 蛋白定位 如Fig 5所示，綠色熒光為Cx43蛋白，藍色熒光為DAPI染色的細胞核，Cx43在HCC827及HCC827 GR細胞中均主要表達在胞質，用GJIC增強劑RA處理(10 μmol·L-1，24 h)后，Cx43仍主要表達在2種細胞的胞質。

3 討論

肺癌是發病率、死亡率均居全球及我國第一位的惡性腫瘤。肺癌絕大多數起源于支氣管黏膜上皮，80%為NSCLC。NSCLC早期診斷率極低，大多數患者確診時已屬晚期或發生轉移，失去手術治療的機會，需要化學藥物治療[9]。目前，臨床常用于NSCLC的藥物吉非替尼是第一個用于NSCLC治療的分子靶向藥物。目前已知，NSCLC患者對吉非替尼獲得性耐藥的主要機制有EGFR T790M突變(50%)[10]和MET擴增(20%)[11]，但仍有約30%的NSCLC患者獲得性耐藥機制未知。因此，探索NSCLC對吉非替尼獲得性耐藥的機制對提高EGFR-TKIs臨床療效，改善NSCLC患者預后有重要意義。

大量研究表明，Cx及其組成的GJ在腫瘤發生發展中有密切的關系，大多數腫瘤發生發展過程中，常伴隨著Cx表達及GJ功能的降低或缺失[12]，如Cx32、Cx43蛋白在肝癌細胞中的表達水平及GJIC的明顯降低可能與肝癌的發生密切相關[13]。長期以來，Cxs被認為是通過建立GJIC來增強腫瘤藥物的敏感性。例如，Cx26蛋白的上調可以增強吉西他濱抗胰腺癌的療效，且依賴于GJIC的功能[14]；另一方面，GJIC功能的增強能夠增強順鉑的細胞毒性作用[15]。然而，近年來一些研究表明，Cxs能夠不依賴GJIC促進腫瘤化療耐藥。例如，Cx43可獨立于GJIC，促進神經膠質瘤細胞對替莫唑胺的耐藥性[16]；Cx43可促進惡性間皮瘤對順鉑的耐藥性，而與其GJIC無關[17]。我們最近的研究也發現，Cx26可獨立于GJIC，與PI3K/Akt相互激活，從而誘導EMT，促進NSCLC吉非替尼耐藥[5]。在本研究中，我們發現與親本細胞HCC827相比，Cx43在HCC827 GR中的mRNA和蛋白表達明顯降低，并且在親本細胞HCC827和耐藥細胞HCC827 GR中GJIC均缺失，Cx43蛋白均主要定位在胞質。這提示HCC827 GR細胞胞質中Cx43表達的下調可能與促進NSCLC吉非替尼的獲得性耐藥有關，并且GJIC不參與該過程。

最近研究發現，PI3K/Akt信號通路在EGFR-TKIs產生耐藥性中也發揮重要作用[18]。PI3K/Akt通路的激活和HCC細胞發生EMT，從而對順鉑產生耐藥有關[19]；在頭頸部鱗狀細胞癌中，PI3K/Akt通路的激活能夠使細胞對吉非替尼產生抗性[20]。在本研究中，我們發現，在HCC827 GR中Cx43蛋白減少的同時，p-Akt蛋白表達明顯升高。進一步的研究發現，在HCC827 GR細胞上加PI3K特異性抑制劑后，能夠明顯抑制p-Akt蛋白的表達，且能夠明顯升高Cx43蛋白的表達。結合上述文獻報道，我們推測，Cx43本身可能獨立于GJIC，與PI3K/Akt之間形成負性調控，從而促進NSCLC細胞對吉非替尼的獲得性耐藥。但胞質中Cx43與PI3K/Akt之間的相互調控，還需進一步的深入研究。

A: The expression of Cx43 was detected in HCC827 and HCC827 GR cells through RT-PCR; B: The expression of Cx43 was detected in HCC827 and HCC827 GR cells through Western blot.*P<0.05vsparental group

Fig 3 The protein expressions of p-Akt (A) and

*P<0.05,**P<0.01vsparental group

綜上所述，我們初步發現了Cx43在NSCLC吉非替尼獲得性耐藥中的作用及可能的分子機制，即Cx43是抑制NSCLC吉非替尼耐藥的一個重要因素。這一發現將為深入了解Cx家族在腫瘤化療耐藥中的作用，以及尋找克服NSCLC分子靶向藥物耐藥的靶點，提供新的理論依據。

Fig 4 GJIC in NCI-H460 as positive control was confirmed

Functional GJIC was detected by parachute assay and no detectable GJIC was found in HCC827 and HCC827 GR cells. No enhancement of GJIC in these cells incubated with 10 μmol·L-1of RA (a well-defined GJIC enhancer) for 24 h. Top: fluorescence images. Bottom: overlaid the corresponding phase-contrast images.Original magnification,×200

Fig 5 Immunofluorescence staining of cellular localization of Cx43 with or without RA treatment

(致謝：感謝廣西醫科大學醫學科學實驗中心提供的實驗條件和技術支持！)

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Effect of Cx43 on acquired gefitinib-resistance mechanisms in human NSCLC HCC827 cells

LUO-Min1, LUO Yan-mei1, QIN Gui-hui1, TENG Cui-fang1, WANG Han-lin2, YANG-Jie1

(1.DeptofPharmacology,SchoolofPharmacy,2.SchoolofClinicalMedicine,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Aim To explore the effect of connexin 43 (Cx43) on acquired gefitinib-resistance in human non small cell lung cancer(NSCLC). Methods HCC827 GR, a gefitinib-resistant (GR) NSCLC cell lines from their parental cells was established by gradually increasing the concentration of gefitinib. Gefitinib efficacy in HCC827 and HCC827 GR cells was detected by MTT assay. Expression of Cx43 mRNA in HCC827 and HCC827 GR cells was determined by RT-PCR. The protein expressions of Cx43 and phospho-Akt (p-Akt) in these cells were detected by Western blot. The functional gap junction intercellular communication(GJIC)was measured by parachute assay. The cellular localization of Cx43 protein was evaluated by immunofluorescence staining. Results MTT assay showed less gefitinib cytotoxicity in HCC827 GR cells than that in their parental cells with IC50of (10.84±0.021) μmol·L-1versus (0.07±0.019) μmol·L-1, respectively. Moreover, both mRNA and protein expressions of Cx43 in HCC827 GR cells were significantly lower than those in HCC827 cells (P<0.05). However, the p-Akt protein in HCC827 GR cells was obviously higher than that in HCC827 cells (P<0.05). Furthermore, treatment with LY294002 caused a significant reduced p-Akt expression, but a significant increased Cx43 expression in HCC827 GR cells. Moreover, no detectable GJIC was found in HCC827 and their GR cells with or without RA (a well-defined GJIC enhancer) treatment. Immunofluorescence staining clearly showed that Cx43 protein accumulated in the cytoplasm of HCC827 and their GR cells. Conclusion The down-regulation of Cx43 expression in cytoplasm of HCC827 GR cells may contribute to the acquired gefitinib resistance in NSCLC cells by GJIC-independent activation of PI3K/Akt signaling pathway.

NSCLC; Cx43; gefitinib; acquired resistance; PI3K/Akt signaling pathway; GJIC

2016-07-01，

2016-07-27

國家自然科學基金資助項目(No 81260324)；教育部高等學校博士學科點專項科研基金新教師類資助項目(No 20124503120008)

駱 敏(1990-)，女，碩士生，研究方向：腫瘤轉移和耐藥；E-mail: 83822984@qq.com；

陽 潔(1978-)，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：腫瘤藥理學，通訊作者，Tel: 0771-5350258, Fax: 0771-5354506，E-mail: yanglz2005@126.com

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.014.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.007

A

1001-1978(2016)11-1510-07

R329.25；R341；R734.202.2；R977.6