Let-7家族與肺部疾病研究進展

羅妍妍，吳升華，陳筱青

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·新進展·

Let-7家族與肺部疾病研究進展

羅妍妍，吳升華，陳筱青

210029江蘇省南京市，南京醫科大學第一附屬醫院

【摘要】MicroRNA(miRNA)是一類內源性、廣泛分布的非編碼RNA，這些非編碼RNA通過調控基因表達的方式參與生命活動的一系列重要的過程，包括細胞增殖、凋亡、分化、個體發育等。Let-7家族是繼Lin-4之后于2000年發現的第二個miRNA家族，目前認為Let-7家族與腫瘤、心血管疾病、病毒感染等發生發展有關，尤其是與肺部疾病關系密切。本文將針對Let-7家族與肺部疾病(肺癌、肺發育不良、肺損傷、特發性肺纖維化、肺部炎癥)的研究進展進行綜述。

【關鍵詞】微RNAs；基因調控；肺疾病；Let-7

羅妍妍，吳升華，陳筱青.Let-7家族與肺部疾病研究進展[J].中國全科醫學，2016，19(17)：1998-2001.[www.chinagp.net]

Luo YY，Wu SH，Chen XQ.Research progression of Let-7 and pulmonary diseases[J].Chinese General Practice，2016，19(17)：1998-2001.

MicroRNA(miRNA)是一個大家族，廣泛存在于動植物、細菌及病毒中，種類豐富，是高度保守的小分子單鏈非編碼RNA分子，長度為22～24個核苷酸，由于其存在的廣泛性和多樣性，通過調控基因表達的方式在細胞的生命活動中發揮重要作用。研究證明在哺乳動物體內，miRNA參與調控超過60%的蛋白編碼基因的活性，調節了包括細胞增殖、周期、遷移、分化和凋亡等在內的幾乎所有已知的細胞生理過程，并且miRNA表達的改變與人體的生理功能紊亂密切相關[1]。miRNA由基因編碼，首先由RNA聚合酶2轉錄形成單個或成簇的miRNA前體，即初微RNA(Pri-miRNA)，然后逐步轉化為成熟的miRNA，前體分子在細胞核內首先由Drosha酶處理成約70個核苷酸的發夾狀前體，即前微RNA(Pre-miRNA)，繼而轉運出核，被Dicer酶加工成22個核苷酸左右的成熟miRNA。成熟的miRNA主要通過與靶基因的3′UTR(非編碼區)結合形成完全和不完全互補，通過切割裂解和翻譯抑制的方式在轉錄后水平負性調控基因的表達。Let-7是2000年發現的第二個miRNA家族，目前發現的Let-7人類有13種，小鼠有14種，但不同動物之間的Let-7序列相對保守。人類的Let-7家族成員分別是Let-7a、a-2、a-3、7b、7c、7d、7e、f7-1、f7-2、7g、7i、mir-98、andmir-202。Let-7最早是在秀麗隱桿線蟲的X染色體上發現，繼而大量實驗發現Let-7在人類的2、3、5、9、18、X等多條染色體上均存在，在上皮細胞、成纖維細胞、單核細胞、腺細胞等多種細胞內廣泛存在，且廣泛分布于肺、肝、胰腺、前列腺等多種組織內，參與了各器官功能的調節。Let-7的表達水平在胚胎時期很難檢測，但是在胚胎分化后或成熟的組織中表達明顯上升。研究發現Let-7的主要功能包括調節干細胞分化、神經肌肉形成、細胞增殖和細胞分化，Let-7與肺癌、肺發育不良、肺損傷、肺纖維化和肺部炎癥等有著密切聯系[1]。本文將圍繞Let-7與肺部幾種常見疾病進行論述。

1Let-7與肺癌

Let-7家族與人類多種癌癥(肺癌、乳腺癌、胰腺癌等)的發生發展密切相關，其一方面通過下調多種原癌基因的表達來發揮抑癌作用，例如在人體內，突變的K-Ras陽性肺癌細胞中過表達的Let-7可以抑制腫瘤的生長；過表達的Let-7還可以抑制乳腺癌起始細胞的形成和轉移。研究證明Ras、C-Myc、HMGA及P53是關鍵性的肺癌致癌基因，其中報道最多的是Ras和HMGA。Johnson等[2]發現人類Ras家族成員(H-Ras、K-Ras、N-Ras)的mRNA的3′UTR存在多個Let-7的互補結合位點，受Let-7家族調控。一方面Let-7通過抑制細胞增殖發揮抑制癌癥的作用，Let-7在不同細胞中表達量的增加是有差別的，這種差別主要體現在高度分化成熟的組織中，其在這些組織中通過監控DNA復制、有絲分裂和胞質分裂來抑制細胞增殖。另外，Let-7家族還可以抑制細胞周期調節因子，如CDC25A、CDK6和CyclinD2。Johnson等[2]體外實驗研究發現Let-7在正常肺組織中呈高表達，且可抑制細胞增殖通路；而在癌細胞中過表達Let-7則會改變細胞周期，減少細胞分割，提示Let-7在正常肺組織中具有抑制腫瘤細胞生長的作用，這一發現支持了Let-7與肺癌細胞增殖相關的學說。

肺癌是最常見、病死率最高的惡性腫瘤，分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)兩種組織類型，其中NSCLC包括鱗癌、腺癌、大細胞癌及混合型肺癌等。Let-7家族的多個成員具有抑癌作用，研究發現Let-7與NSCLC中HMGA2、C-Myc等的表達存在明顯的相關性[3]。進一步研究證明Let-7在NSCLC中起抑癌基因的作用，并且調控HMGA2、C-Myc這兩種肺癌關鍵的致癌基因。Kumar等[4]異種移植實驗發現Let-7的腫瘤抑制效應在具有K-Ras變異型的人和小鼠的NSCLC細胞系中表現更為突出。HMGA是保證癌細胞獨立生長和遷移的一種染色體非組蛋白基因，其致癌機制尚不明確，有研究認為HMGA通過促進染色體易位和上調轉錄水平致癌，HMGA的3′UTR區也有多個調節靶位，靶位的變異和缺失會促進細胞癌變[5]。Wang等[6]實驗結果證明Let-7c通過調節TRIB2的表達和其下游因子可以有效地抑制A549細胞的體內和體外增殖。有學者將外源性的Let-7a轉染肺癌細胞A549和NCI-H446，MTT結果顯示兩株細胞的生長均受到抑制，細胞周期實驗結果顯示轉染可使肺癌細胞停滯在G0/G1期，并可通過下調Bcl-2、C-Myc基因和上調P53基因引起細胞凋亡[7]。Tsai等[8]研究發現Let-7b、Let-7e低表達和cofilin-1(絲切蛋白，肌動蛋白調節蛋白的非肌肉亞型)的高表達抑制了細胞增殖和浸潤。Takamizawa等[9]研究發現肺癌組織中低表達Let-7的患者預后較差，推測Let-7可能是影響肺癌預后的一個獨立危險因素。

2Let-7與肺發育不良/肺損傷

支氣管肺發育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是新生兒中越來越常見的氣道慢性疾病，主要發生在極低和超低出生體質量兒，潛在的致病機制尚未明確闡述，目前認為該病與長期的氧療和機械通氣導致肺損傷和肺臟的異常發育有關[10]。

miRNA作為基因調控因子，不僅可以調控細胞的增殖、分化、遷移和凋亡，還可以調控腫瘤和器官發育，研究證明多種miRNA與肺臟的發育有密切關系[11]。miRNA與肺發育的相關研究日漸深入，眾多miRNA包括Let-7家族參與了肺發育的調控，為維持肺發育穩定所必需。在肺發育的miRNA研究中，無疑Let-7家族和miR-17-92簇研究最多且最為深入。Ras蛋白作為Let-7的重要靶點，位于酪氨酸激酶通路的下游，在其通路中含有纖維生長因子受體，而纖維生長因子受體在肺胚芽發育及內皮增殖中起重要作用。該受體對肺分支形態發育和上皮細胞增殖非常重要，故Let-7家族的高表達在新生兒肺發育過程中發揮了重要作用。Yang等[12]采用包含1 891個捕獲探針的miRNA芯片檢測大鼠肺發育過程中3個不用時間點(16 d胎齡、19 d胎齡、21 d胎齡)miRNA的表達，通過實時PCR檢測發現在大鼠肺發育過程中有167種miRNA有不同程度的表達，其中包括81種上調miRNA和86種下調miRNA。其中7種miRNA(miR-Let-7a、miR-1949、miR-125b-5p、miR-296、miR-93、miR-146b、miR-3560)在3個不同時間點檢測含量均超過了參考值的兩倍以上，miR-1949、miR-125b-5p、miR-296、miR-93表達下調，而miR-146b、miR-3560、miR-Let-7a表達上調。同時又有研究證實Let-7家族在不同種屬出生后表達穩定上調，顯示了其遺傳的穩定性。Chen等[13]在脂多糖(LPS)的免疫應答中發現，Let-7在依賴MyD88/NF-κB的方式下減少，同時伴有Toll樣受體4(TLR4)的增加，這些發現證明Let-7家族在肺的免疫應答中也是必需的。另外Yang等[14]發現Let-7a在3個不同時間點胎肺中的表達量均超過了參考值的兩倍以上。Zhang等[15]研究表明在大潮氣量誘導的肺損傷模型中，Let-7家族亦呈現顯著下調，提示Let-7家族與肺損傷關系密切。這些研究結果為將來研究BPD提供了更深刻的生理學基礎。

3Let-7與特發性肺纖維化(IPF)

IPF是病因未明的慢性肺間質纖維化的肺部疾病，主要發生在老年人，病因不明，目前尚無有效的藥物治療，病死率高。活動性IPF的直接特征是成纖維細胞灶的出現，早期研究認為IPF與異常的侵襲性纖維增殖和肌成纖維細胞轉化增加有關[16]。研究發現miRNA在肺纖維化中發揮重要作用，這對IPF患者的診斷和治療意義重大。Yang等[17]通過檢測健康人和IPF患者血清中的miRNA，發現急慢性IPF患者血清中有47種miRNA出現不同程度的表達，包括21種上調miRNA和26種下調miRNA，進一步研究發現：與健康人相比，IPF患者血清中的Let-7a和Let-7d明顯下調，機制涉及轉化生長因子β1(TGF-β1)及下游信號通路。Pandit等[18]為SMAD蛋白結合物(SBE)掃描了差異表達的miRNA，在Let-7d中發現了1個SBE的上游物質。其利用染色體免疫沉積的方法通過SMAD抗體的物理學性質結合SMAD到假定的Let-7d啟動子上，熒光素酶活性檢測證明當TGF-β1存在時熒光素酶的活性減低，Let-7d位于正常人的肺泡上皮細胞中，Let-7d陽性細胞的數量與用力肺活量呈正相關，該研究表明TGF-β1是肺纖維化的關鍵調節因子，Let-7d是實現正常肺功能必需的物質[19]。通過氣管給藥的方式限制Let-7家族的所有成員導致了提示上皮間質轉化的間充質標志物的上調和上皮性標志物的下調。但是，抑制Let-7可以導致纖維化的準確分子機制仍不清楚，在Let-7的抗纖維化作用中，抑制KRAS、Myc、CyclinD2、cdk6、cdc25a和HMGA2可能均發揮了同樣重要的作用。早期研究發現Let-7水平也可預測胰島素樣生長因子1(IGF-1)和IGF-1受體的水平，在IPF中，肺泡和間質巨噬細胞、間質細胞、上皮細胞中的IGF-1水平上升，這些可以刺激產生膠原蛋白[20]。隨著對研究的深入，Let-7有可能成為研究IPF有效治療方法的切入點。

4Let-7與肺部炎癥

Let-7除了與肺癌、肺發育不良、肺纖維化等疾病密切相關，在肺部炎癥和免疫應答方面也起著重要作用。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的成分，是內毒素和重要群特異性抗原，也是感染導致肺部損傷的重要因素。內毒素可刺激淋巴細胞和單核細胞產生白介素(IL)和腫瘤壞死因子(TNF)等細胞因子，引起急性期的發熱和氣道炎癥。Chen等[13]發現，在LPS刺激下，Let-7i表達逐漸下調，并伴有TLR4增加，Let-7b和Let-7g也有類似的表現，這些發現提示Let-7家族與維持肺部正常免疫功能相關。Moschos等[21]采用LPS誘導固有免疫時發現，有46種miRNA出現快速而短暫的升高，其中Let-7家族成員發生了明顯的升高，同時伴有TNF和巨噬細胞炎癥蛋白2的表達下降，提示miRNA可以調節炎性細胞因子。中性粒細胞在肺部炎性反應中起重要作用，而Let-7可以調節中性粒細胞的聚集、炎性遞質的形成和分泌，調節人肺泡上皮細胞急性炎性反應。

此外，研究發現miRNA家族中的Let-7家族與過敏性氣道炎癥密切相關。IL-13是Th2細胞和其他細胞分泌的細胞因子，在寄生蟲感染時促進宿主防御，精密地調節過敏性炎癥和過敏性哮喘的組織重構[22]。Kumar等[23]發現Let-7家族可以在轉錄后水平調節IL-13的表達，在IL-13依賴的過敏性氣道炎癥的小鼠模型中發現，炎癥的發生與Let-7家族成員的減少有關。模擬過敏性炎癥的小鼠外源性給予Let-7，導致IL-13的表達下降，降低了氣道炎癥和氣道高反應性，減少了黏液分泌和上皮纖維化。

miRNA與慢性阻塞性肺疾病(COPD)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的研究有待進一步開展，更多地了解Let-7與炎性反應的關系，將有可能成為炎性疾病新的治療方向。

5小結

miRNA的相關研究是近年的研究熱點，Let-7家族作為第一個被發現的人類miRNA，對疾病的致病機制、診斷和預后的判斷提供了線索。目前，Let-7家族在呼吸系統的研究主要集中在肺癌、肺纖維化、肺部炎性疾病、COPD、ARDS等方面，在肺損傷、肺發育不良等領域的研究尚有待于更深入地開展。相信隨著Let-7的調控機制研究不斷深入，可以為呼吸疾病防治提供新方法，為靶向藥物開發提供新思路。

本文文獻檢索策略:

本文所引中文參考文獻來源于中國知網及萬方數據知識服務平臺，英文參考文獻來源于PubMed英文數據庫。關鍵檢索詞匯有：micro RNA，Let-7，bronchopulmonary dysplasia，pulmonary fibrosis，lung cancer，pulmonary inflammation，lung injury and premature，早產，支氣管肺發育不良，肺纖維化，肺癌，肺部炎癥和肺損傷等，優先選用近5年發表的文獻。把檢索到的文獻歸結起來，通過閱讀文題、摘要，排除重復和不符合要求的文獻。

作者貢獻：羅妍妍進行參考文獻的收集及撰寫工作；吳升華負責文章的修改與整理工作；陳筱青負責審校及投稿雜志的選擇工作。

本文無利益沖突。

參考文獻

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(本文編輯：賈萌萌)

Research Progression of Let-7 and Pulmonary Diseases

LUOYan-yan，WUSheng-hua，CHENXiao-qing.

TheFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，China

【Abstract】MicroRNA(miRNA)is a class of endogenous non coding RNA and is widely distributed.It involves a series of important processes in life activity through the regulation of gene expression patterns，including cell proliferation，apoptosis，differentiation and individual development.Let-7 family is the second member of the miRNA family，discovered after Lin-4 in 2000，and is thought to be related to the occurrence and development of tumor，cardiovascular diseases，viral infections and pulmonary diseases，especially.In this review，we focused on the recent research progress of miRNA Let-7 family and pulmonary diseases such as pulmonary cancer,bronchopulmonary dysplasia，pulmonary injury，pulmonary fibrosis and pulmonary inflammation.

【Key words】MicroRNAs；Gene regulation；Lung diseases；Let-7

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81300521)

【中圖分類號】R 342.2 R 563

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.17.003

(收稿日期：2015-09-28；修回日期：2015-12-30)