流式細胞術檢測登革熱患者T淋巴細胞研究

石亞玲，趙　蓉，陳偉烈

(廣州市第八人民醫院：1.檢驗科；2.研究所，廣東廣州 510060)

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流式細胞術檢測登革熱患者T淋巴細胞研究

石亞玲1，趙蓉1，陳偉烈2

(廣州市第八人民醫院：1.檢驗科；2.研究所，廣東廣州 510060)

摘要:目的探討登革熱患者的免疫狀況。方法流式細胞術檢測登革熱患者的T淋巴細胞，從而分析患者的免疫狀況。結果與健康者的參考范圍進行比較，發現登革熱患者的T淋巴細胞比例相對于健康者顯著降低。CD3+CD4+、CD3+CD8+的淋巴細胞百分比分別為(36.54±9.78)%、(17.7±10.01)%，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；CD3+CD4+的淋巴細胞數為(49.98±240.2)cells/μL，差異有統計學意義(P<0.05)、CD3+CD8+細胞數為(380.9±364.6)cells/μL，差異有統計學意義(P<0.05)，CD3+細胞數(874.8±541.2)cells/μL，差異有統計學意義(P<0.05)。結論登革熱患者免疫狀況異常，T淋巴細胞比例相對于健康者顯著降低。

關鍵詞:流式細胞術；登革熱；免疫狀況

登革熱是由登革病毒引起，經伊蚊傳播的一種急性傳染病，潛伏期通常約5～7 d，具有傳播迅猛、發病率高等特點。登革熱患者有可能出現極度疲倦及抑郁癥狀，少數患者會惡化至登革出血熱，并進一步發生出血、休克，乃至死亡，登革熱引起的并發癥往往是患者致死的主因。一般來說登革熱主要分布在熱帶及亞熱帶地區。每年世界上有1億人受到登革病毒感染，近年來，隨著旅游業的發展和全球溫暖化，登革熱疫情日益嚴重，已經成為一個世界性的嚴重公共衛生問題[1]。郭汝寧等[2]報道2005～2010年廣東每年都有發生登革熱病例現象。

登革熱發病機制至今尚未完全清楚，相關假說有:病毒親嗜性、病毒毒力學說、宿主的易感因素、抗體依賴性增強感染作用(ADE)、交叉反應性T細胞反應及細胞因子風暴等假說。登革病毒通過伊蚊叮咬進入人體，在單核-巨噬細胞系統和淋巴組織中復制至一定數量后，即進入血循環(第1次病毒血癥)，然后再定位于單核吞噬系統和淋巴組織之中[3]。

交叉反應性T細胞的激活假說是促進登革病毒感染臨床進程的關鍵，與DHF/DSS發生有關。CD8+T細胞可以在DENV感染早期控制病毒感染，但是，在清除感染細胞的同時CD8+T也參與了DENV感染的病理過程。病毒可以誘導出不同的交叉反應性T細胞反應，這些低親和力非中和性的細胞無法有效地清除病毒。在初次感染登革病毒的小鼠中，只產生少量的登革特異性CD4+T細胞；然而，4個血清型的登革病毒二次感染后將導致CD4+T 細胞的反應明顯增加，不但提高了CD4+T細胞的INF-γ分泌水平，也增加了CD8+T 細胞的活化[3-4]。

本實驗通過流式細胞術對登革熱患者的T淋巴細胞進行檢測，分析患者是否出現T細胞免疫異常。

1資料與方法

1.1一般資料收集本院確診登革熱患者1 112例，平均年齡(48.5±10.88)歲，無相關自身免疫性疾病、腫瘤或近期感染史，50例健康者作為對照組。登革熱患者的主要臨床癥狀：發熱、食欲下降、惡心、嘔吐；皮疹持續3～4 d，一般與發熱同時消退；不同部位、不同程度的出血，如消化道出血，血尿及陰道出血等；淋巴結腫大。

1.2儀器與試劑儀器為BD CantoII，試劑為CD3、FITC/CD8、PE/CD45、PERCP/CD4、APC、溶血素、絕對計數管，均購自BD公司。

1.3方法抗體與外周血加入絕對計數管中孵育15 min，加入500 μL 1×溶血素，避光孵育10 min，震蕩混勻，上機檢測。1.4統計學處理使用SPSS13.0統計軟件進行統計分析，若方差不齊，則組間比較采用秩和檢驗。使用GraphPad Prism5軟件進行作圖分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

流式細胞術檢測出各細胞絕對計數值，與健康者進行比較，發現登革熱患者的T淋巴細胞比例相對于健康者顯著降低。CD3+CD4+、CD3+CD8+的淋巴細胞百分比分別為(36.54±9.78)%、(17.7±10.01)%，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；CD3+CD4+的淋巴細胞數為(49.98±240.2)cells/nL，差異有統計學(P<0.05)、CD3+CD8+細胞數為(380.9±364.6)cells/nL，差異有統計學意義(P<0.05)，CD3+細胞數(874.8±541.2)cells/nL，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

1 112例登革熱患者中，總體趨勢相對健康者是降低，但是也有患者在正常范圍之內，也有患者是呈升高趨勢:其中CD3+低于正常值的人數占64%，高于正常值的占2%；CD3+CD4+低于正常值的人數占60%，高于正常值的占1%；CD3+CD8+低于正常值的人數占50%，高于正常值的占7%,Th/Ts低于正常值的人數占6%，高于正常值的占16%。

表1　　登革熱患者與健康者T細胞統計

*：P<0.05，與對照組比較。

圖1　　登革熱患者與健康者T細胞比較

3討論

對于登革病毒，目前并沒有特異的疫苗與病原治療藥物，主要采取對癥治療措施，醫生盡可能做到早發現、早隔離、早治療[5-6]。登革出血熱，有休克、出血等嚴重癥狀，需積極處理。休克者應及時補充血容量，可選用右旋糖酐40(低分子右旋糖酐)、平衡鹽液、葡萄糖鹽水等。目前很多種具有應用前景的登革熱疫苗和抗病毒藥物正在開發,進入臨床試驗階段，但是仍存在許多亟待解決的問題[7]。

登革熱發病機制至今仍未完全闡明，其癥狀的嚴重程度受多種因素的影響。初次感染登革病毒,臨床上表現為典型登革熱,不發生出血和休克。再次感染異型登革病毒時,病毒在血液中與原有的抗體結合,形成免疫復合物,激活補體,引起組織免疫病理損傷,臨床上呈現出血和休克。涉及參與的免疫反應包括體液免疫、細胞免疫、Fc受體介導的細胞凋亡等多個機制,彼此相互交錯、促進和制約,推動疾病的進程[8]。

宿主的易感性影響到宿主對登革病毒感染的免疫應答，而免疫應答產生的細胞因子和交叉反應性T細胞在清除病毒的同時又可以引起組織和細胞損傷，加之病毒血清型毒力不同，產生的二次感染誘導ADE，使病理過程更加嚴重。最近有研究同樣表明，登革病毒感染后首要靶細胞是單核細胞，而不是T 細胞或B 細胞[3,9-10]。

本研究中，流式細胞術檢測出各細胞絕對計數值，與健康者進行比較，發現登革熱患者的T淋巴細胞比例相對于健康者顯著降低。CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+與健康者相比顯著降低。在1 112例登革熱患者中，總體趨勢相對健康者是降低，但是也有患者在正常范圍之內，也有患者是呈升高趨勢:其中CD3+低于正常值的人數占64%，高于正常值的占2%；CD3+CD4+低于正常值的人數占60%，高于正常值的占1%；CD3+CD8+低于正常值的人數占50%，高于正常值的占7%,Th/Ts低于正常值的人數占6%，高于正常值的占16%。大多數研究機制都說明T細胞會降低[11]，本研究中發現有一部分登革熱患者T細胞升高，不管是升高還是降低，說明其免疫機制是紊亂的，具體的免疫機制需要進一步的研究。

參考文獻

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[11]Godoy-Ramirez K,Franck K,Mahdavifar S,et al.Optimum cul ture conditions for specific and nonspecific activation of whole blood and PBMC for intracellul ar cytokine assessment by flow cytometry[J].J Immunol Methods,2004,292(12):1-15.

·論著·

Study on flow cytometry for detecting T lymphocytes in patients with dengue fever*

ShiYaling1,ZhaoRong1,ChenWeilie2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.ResearchInstitute,GuangzhouMunicipalEighth

People′sHospital,Guangzhou,Guangdong510060,China)

Abstract:ObjectiveTo investigarte the immune status in the patients with dengue fever.MethodsThe flow cytometry was used to detect the T lymphocytes in the patients with dengue fever for analyzing their immune status.ResultsCompared with the reference range in the healthy individuals,it was found that the T lymphocyte proportion in the patients with dengue fever was significantly reduced compared with the healthy individuals.The percentages of CD3+CD4+and CD3+CD8+lymphocytes were (36.54±9.78)% and (17.7±10.01)% respectively,which had statistical difference compared with the control group(P<0.05),CD3+CD4+lymphocyte count was (49.98±240.2)cells/μL,the difference was statistically significant (P<0.05),CD3+CD8+lymphocytes count was (380.9±364.6)cells/μL,the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe immune status in the patients with dengue fever is abnormal,T lymphocyte percentage is significantly reduced compared with the healthy individuals.

Key words:flow cytometry；dengue fever；immune status

作者簡介：潘秋榮，男，副主任檢驗師，主要從事臨床免疫學檢驗研究。

收稿日期：(2015-05-12)

文獻標識碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.013A

文章編號：1673-4130(2015)24-3541-02