流式微球技術(shù)定量檢測(cè)血小板膜糖蛋白在ITP中的應(yīng)用價(jià)值探討*

基金項(xiàng)目:陜西省西安市科技局資助基金項(xiàng)目(2012014)。

郭　亮，宋艷萍，王　浩，賈學(xué)友，郭曉波

(西安市中心醫(yī)院血液科,陜西西安 710000)

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流式微球技術(shù)定量檢測(cè)血小板膜糖蛋白在ITP中的應(yīng)用價(jià)值探討*

*基金項(xiàng)目:陜西省西安市科技局資助基金項(xiàng)目(2012014)。

郭亮，宋艷萍，王浩，賈學(xué)友，郭曉波

(西安市中心醫(yī)院血液科,陜西西安 710000)

摘要:目的應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)血小板表面膜糖蛋白，評(píng)價(jià)其在血小板減少性紫癜(ITP)診斷中的價(jià)值。方法選取2013年1月至2015年2月門診及住院部收治的77例ITP患者(ITP組)、43例非免疫性血小板減少癥患者(NITP組)及同期進(jìn)行健康體檢的健康者30例(健康對(duì)照組)為研究對(duì)象。應(yīng)用鼠抗人GPⅡb/Ⅲa單抗、GPIa/Ⅱa單抗、GP Ib/Ⅸ單抗包被微球，采集空腹靜脈血分離血樣中血小板，將血小板裂解后與包被過的微球共同孵育，應(yīng)用流式細(xì)胞儀結(jié)合間接熒光免疫法檢測(cè)并比較三組血小板表面膜糖蛋白。分析流式微球技術(shù)診斷ITP的敏感度與特異度。結(jié)果ITP組患者血小板表面GPⅡb/Ⅲa、GPIa/Ⅱa、GP Ib/Ⅸ的水平均明顯高于NITP組及健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，NITP組患者高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。流式微球技術(shù)對(duì)ITP的診斷敏感度為92.2%(71/77)，特異度為89.0%(65/73)，準(zhǔn)確度為90.7%(136/150)。結(jié)論應(yīng)用流式微球技術(shù)定量檢測(cè)血小板膜糖蛋白對(duì)診斷ITP有應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞:流式微球技術(shù)；血小板表面膜糖蛋白；血小板減少性紫癜；診斷價(jià)值

特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)是臨床常見的出血性疾病，約占出血性疾病的1/3,患者主要表現(xiàn)為血小板持續(xù)減少，皮膚、黏膜出血，嚴(yán)重者可發(fā)生內(nèi)臟甚至顱內(nèi)出血而危及生命[1]。目前ITP的國(guó)內(nèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)仍為排除法，除血小板減少這一項(xiàng)較肯定外，其他診斷標(biāo)準(zhǔn)都是相對(duì)的，療效反應(yīng)在系統(tǒng)治療后才能判定，故臨床上存在一些難以確診的病例，影響臨床治療，因此，尋找敏感而特異的檢測(cè)方法，對(duì)提高ITP的診斷有重要意義[2-3]。本研究選取2013年1月至2015年2月本院收治的77例ITP患者為研究對(duì)象，探討流式微球技術(shù)定量檢測(cè)血小板膜糖蛋白在ITP中的應(yīng)用價(jià)值，為其診斷提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料ITP組：ITP患者77例，均本院2013年1月至2015年2月門診及住院患者，其中男32例，女45例，男∶女=1.4∶1，年齡14~78歲，平均年齡45歲，均符合ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。NITP組：非免疫性血小板減少患者43例，其中男性26例，女性17例，年齡16～78歲，平均年齡45歲，淋巴瘤患者9例，再生障礙性貧血患者27例，骨髓異常增生綜合征患者7例。健康對(duì)照組：本院體檢中心健康者30例，其中男12例，女18例，男：女為1.5∶1，年齡15～79歲，平均46歲。

1.2儀器與試劑FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckon Dickinson公司)。BD FACS Lysing Solution(溶血素)和BD Cailibrite 3 Beads(流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)試劑)等全部為BD進(jìn)口試劑。QuantumPlex4.4um-carboxy1全部為Bangslabs公司進(jìn)口微球。

1.3方法微球包被：用200 mg/mL的血小板膜糖蛋白單克隆抗體(抗-GPⅡb/Ⅲa、抗-GPIa/Ⅱa、抗-GP Ib/Ⅸ)分別包被QuantumPlex4.4um微球，抗體包被按照微球熒光從低到高的順序進(jìn)行[5]。包被過程如下：200 μL QuantumPlex4.4μm微球l 000 r/min離心15 min，棄上清液。加入400 μL蛋白偶聯(lián)緩沖液，1 000 r/min離心15 min，棄上清液。加入200 μL蛋白偶聯(lián)緩沖液和 20 μL濃度為20 mg/mL的EDAC活化劑，活化15 min，加入100 μg抗體，室溫包被4 h。1 000 r/min離心15 min，棄上清液，加入400 μL清洗/貯存液，4 ℃存放。流式檢測(cè)：用200 μL O型血小板和血清在37 ℃下孵育30 min后，用PBS(EDTA，BSA)洗3遍，加入 150 μL血小板裂解液后，放置4 ℃30 min，2 500 r/min離心15 min，取上清液。加入100 μL血小板裂解液，25 μL微球，避光孵育3 h，用PBS(Tween20，BSA)洗2遍，加入羊抗人IgG-FITC、IgM-PE10 μL，避光孵育60 min，用PBS(Tween20，BSA)洗1遍，加400 μL PBS(Tween20，BSA)，上機(jī)檢測(cè)并獲取10 000個(gè)微球。同時(shí)將30個(gè)健康體檢者人作為對(duì)照樣本，并得到正常對(duì)照幾何平均熒光強(qiáng)度(MFI)[5]。

2結(jié)果

2.13組血小板膜糖蛋白表達(dá)結(jié)果比較ITP組患者血小板表面GPⅡb/Ⅲa、GPIa/Ⅱa、GP Ib/Ⅸ的水平均明顯高于NITP組及健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，NITP組患者高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。結(jié)果見表1。

表1　　三組血小板膜糖蛋白表達(dá)結(jié)果比較±s)

2.2流式微球技術(shù)對(duì)ITP診斷價(jià)值分析ITP組熒光強(qiáng)度比率均值及上下限為5.47(0.48~19.75)，NITP組為1.23(0.70~4.12)，健康對(duì)照組為0.98(0.41~1.62)，ITP組高于NITP組及健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。以健康對(duì)照組上限為分界值，大于1.62為陽(yáng)性，小于1.62為陰性，流式微球技術(shù)對(duì)ITP的診斷敏感度為92.2%(71/77)，特異度為89.0%(65/73)，準(zhǔn)確度為90.7%(136/150)。

3討論

目前ITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)臨床表現(xiàn)和多次化驗(yàn)結(jié)果，血小板相關(guān)免疫球蛋白 (PAIg) 的檢測(cè)是輔助診斷條件之一，但大量研究顯示PAIg升高缺乏特異性，對(duì)ITP診斷幫助甚微，因此有研究者探索使用單克隆抗體固定血小板抗原法(MAIPA)及改良的MAIPA來檢測(cè)血小板膜糖蛋白自身抗體，雖然可以有限的提高自身抗體檢測(cè)的特異度，但因敏感度低、檢測(cè)方法繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)等因素而限制了其臨床應(yīng)用。

ITP的發(fā)生是由于自身抗體致敏的血小板被單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)過度破壞所致，而自身抗體通常針對(duì)的是血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa、GPIb/Ⅸ這些較為重要的靶抗原，除此之外還有GPIa/Ⅱa、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、GMP140等。這些少見類型的抗原決定簇有助于進(jìn)一步揭示血小板自身抗體加劇ITP的發(fā)病機(jī)制[6-7]。流式微球技術(shù)(CBA)是一種新的高通量檢測(cè)方法，通過使用不同熒光編碼大小的聚合微球，可以同時(shí)分析復(fù)雜樣品中的多種分析物[8]。每一種微球表面被修飾使其與相應(yīng)的待測(cè)抗原或抗體反應(yīng)，將不同微球混合即可進(jìn)行多重復(fù)合測(cè)定，該技術(shù)結(jié)合了熒光編碼微球的特異性與流式細(xì)胞儀的高度敏感性。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)血小板表面膜糖蛋白，評(píng)價(jià)其在ITP診斷中的價(jià)值，結(jié)果顯示：ITP患者GPⅡb/Ⅲa、GPIa/Ⅱa、GP Ib/Ⅸ的水平均明顯高于NITP組及健康對(duì)照組，而流式微球技術(shù)對(duì)ITP的診斷敏感度為92.2%(71/77)，特異度為89.0%(65/73)，高于目前臨床上應(yīng)用的PAIg檢測(cè)(特異度19%~27%)及MAIPA(敏感度39.0%~51.8%)，提示作為一個(gè)技術(shù)分析平臺(tái)，流式熒光微球技術(shù)大大提高ITP診斷敏感度及特異度，具有較高的推廣價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

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·臨床研究·

收稿日期：(2015-09-22)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.044A

文章編號(hào)：1673-4130(2015)24-3614-02