血清中艱難梭菌毒素A&B檢測在腹瀉診斷中的應用*

基金項目:深圳市龍崗區科技創新局資助項目(深龍科2014-52號)。

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血清中艱難梭菌毒素A&B檢測在腹瀉診斷中的應用*

*基金項目:深圳市龍崗區科技創新局資助項目(深龍科2014-52號)。

陳日炳，李小峰△，胡琴，李志祥

(深圳市龍崗區人民醫院，廣東深圳 517200)

摘要:目的調查深圳東部地區住院腹瀉患者艱難梭菌感染情況，并評價3種艱難梭菌檢測方法的靈敏度和特異度。方法收集深圳東部地區2014年1月至2015年4月住院腹瀉患者的糞便和血清標本各253份，同時進行糞便標本培養鑒定，酶聯免疫熒光法檢測糞便和血清標本中艱難梭菌毒素A&B水平，對鑒定及檢測結果結合臨床資料進行分析。結果糞便培養(48 h)檢出艱難梭菌10例(3.95%)，糞便中檢測到艱難梭菌毒素A&B 15例(5.93%)；血清中檢測到艱難梭菌毒素A&B 14例(5.53%)。結論檢測血清中艱難梭菌毒素A&B對診治艱難梭菌感染腹瀉的患者有重要意義。

關鍵詞:艱難梭菌；糞便；血清；腹瀉

艱難梭菌是一種革蘭陽性專性厭氧芽孢桿菌，在正常情況下，該細菌受制于人體其他細菌，不會產生危害[1]。但過度應用抗菌藥物、免疫抑制劑或化療藥物可使耐藥的艱難梭菌產毒株過度繁殖并釋放艱難梭菌毒素A&B導致艱難梭菌相關性腹瀉，這對兒童和老年人可能是致命的[2]。隨著艱難梭菌相關性腹瀉的發病率在全球范圍內不斷增加，甚至在北美地區多家醫院內爆發流行，引起了世界范圍的關注，而預防艱難梭菌感染也成為醫院感染控制的新挑戰。細菌培養及鑒定作為艱難梭菌感染的傳統方法，主要是將大便接種至艱難梭菌選擇性培養基，并在厭氧環境下培養48 h。對培養后可疑菌落再行鑒定。該方法雖然較為經典但由于所需周期較長，易延誤治療。而酶聯免疫熒光法艱難梭菌毒素A&B檢測技術采用酶免夾心法與終點免疫熒光相結合，通常以糞便標本檢測為主，可準確預測患者體內菌群致病性，但仍然存在標本采集的局限性[3]，因此本文創新性地提出檢測血清中艱難梭菌毒素A&B的方法。為了解本地區住院腹瀉患者艱難梭菌感染情況，并評價3種艱難梭菌檢測方法靈敏度和特異度，對深圳東部地區三家大型醫院住院腹瀉患者的的糞便和血清進行艱難梭菌毒素檢測，結合細菌培養鑒定結果進行綜合分析，為臨床艱難梭菌感染的治療和控制提供參考，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料2014年1月至2015年4月入住深圳東部地區人民醫院、中心醫院、中醫院發生腹瀉的住院患者253例象，納入標準：根據原衛生部《醫院感染診斷標準》住院時間大于3 d，出現腹瀉癥狀1 d在3次以上；1個月內使用過抗菌藥物，如氟喹諾酮類、頭孢菌素或B-內酰胺類抗菌藥物等；長期使用胃酸抑制劑，如質子泵抑制劑、H2受體阻滯劑等。無明顯抗菌藥物暴露史，但臨床高度懷疑艱難梭菌感染者。排除食物中毒、脂肪瀉、病毒性腹瀉、菌痢、沙門菌屬腹瀉及慢性腹瀉疾病患者[4]。研究對象來源及特征見表1。

1.2儀器與試劑法國梅里埃全自動細菌鑒定儀、螢光酶標儀；荷蘭微需氧培養系統；日本SANYO-CO2培養箱。艱難梭菌產色培養基、厭氧袋和艱難梭菌毒素檢測試劑盒均為法國梅里埃產品。

1.3檢測方法

1.3.1標本采集所有符合納入標準的研究對象，每人收集糞便5 mL，均分于2個干凈無防腐劑的大便標本無菌杯中，立即送檢，同時用生化管采集患者外周全血5 mL，3 000 g離心5 min分離血清，4 ℃保存備用。

1.3.2糞便標本艱難梭菌培養及鑒定一份糞便標本及時接種于艱難梭菌產色培養基,立即置厭氧箱中厭氧環境培養24 h，觀察有無艱難梭菌典型菌落生長(黑色菌落)。若沒有典型菌落，可延遲放置48 h再觀察。取可疑菌落進行鑒定。

1.3.3糞便標本直接檢測艱難梭菌毒素A&B吸取200 μL充分混勻的液體糞便，加入到干凈離心管中，加入1 mL標本稀釋液(R1),渦旋混勻，12 000 g離心5 min，取300 μL上清液待測。具體操作步驟及結果判斷嚴格按照試劑盒說明書

1.3.4血清標本直接檢測艱難梭菌毒素A&B取200 μL待測血清，加入1 mL標本稀釋液(R1),渦旋混勻，12 000 g離心5 min，取300 μL上清液待測。具體操作步驟及結果判斷嚴格按照試劑盒說明書。

1.4統計學處理采用SPSS19.0統計軟件進行數據處理及統計學分析。計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

表1　　研究對象來源及特征(n)

2結果

糞便培養出艱難梭菌10例(3.95%)，糞便中檢測到艱難梭菌毒素A&B 15例(5.93%)；血清中檢測到艱難梭菌毒素A&B 14例(5.53%)。與糞便培養鑒定相比，糞便毒素檢測和血清毒素檢測陽性率明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，而糞便毒素檢測和血清毒素檢測陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。各種方法優缺點見表3。

表2　　各種方法檢測陽性率比較

*：PZ<0.05，與糞便培養法比較。

表3　　各種方法優缺點比較

3討論

近年來隨著抗菌藥物濫用加劇，加之免疫抑制劑和化療藥物應用增多，國內外耐藥性艱難梭菌感染的發生率呈明顯上升趨勢。僅在美國，每年艱難梭菌感染者就超過了40萬例，且感染的病死率高達10%[5]。上海市疾病預防控制中心(CDC)的調查表明，由上海市各大醫院艱難梭菌感染引起的腹瀉高達7.1%[6]，提示我國艱難梭菌感染形勢也很嚴峻，因此選用合適的檢測方法，及時準確地對艱難梭菌感染進行診斷，以及有針對性地用藥對該病預后尤為重要。因此本研究采用糞便培養鑒定、糞便中A&B毒素檢測和血清中A&B毒素檢測3種方法，在調查本地區住院腹瀉患者艱難梭菌感染情況的同時，比較3種方法的可行性。

本研究結果顯示，糞便培養鑒定法的陽性率較低(3.95%)，這可能與厭氧菌對標本采集運送條件嚴苛有關，糞便中優勢菌群如腸桿菌等，也會抑制艱難梭菌的生長，進而影響檢測結果[7]。同時培養法作為檢驗艱難梭菌的傳統方法，培養條件苛刻，對實驗設備要求較高，檢測周期長，加之成本昂貴，無法確定與腹瀉的因果關系，因此該方法已不能滿足當前臨床診治需要。與培養鑒定法相比，用糞便標本檢測A&B毒素，陽性率明顯升高(5.93%)，選用商品化試劑盒，檢測快速，且結果穩定性較好，易于標準化，目前被視為先進方法[8]。但也存在糞便取樣受限，不能做到隨取隨做的缺點。因此本研究中嘗試用血清代替糞便進行艱難梭菌毒素檢測，結果表明糞便毒素檢測和血清毒素檢測陽性率差異無統計學意義(P>0.05)，且血樣抽取受限較少，在患者失去意識、消化系統手術后等無法順利收集糞便標本的特殊情況下，該法具有明顯優勢。但該方法能否廣泛應用仍需大量樣本研究驗證。

本文研究表明深圳東部地區住院腹瀉患者中檢出艱難梭菌A&B毒素的陽性率為5.93%，低于高燕婷等人的研究[9]，這可能與該地區醫療衛生部門良好的抗菌藥物使用習慣有關；感染者多為老年人和兒童，可能與個體的抵抗力有關。

綜上所述，針對特定人群檢測血清中艱難梭菌毒素A&B，對艱難梭菌診治有重要意義。但做好院內感染的防治，降低院內感染的發生,同時嚴格規范抗菌藥物的使用[10]，保持環境衛生及維持腸道內微生抵穩態才能從根本上降低艱難梭菌發病率和病死率。

參考文獻

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·臨床研究·

收稿日期：(2015-08-18)

文獻標識碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.062A

文章編號：1673-4130(2015)24-3641-03

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