自噬與骨肉瘤研究進展

鞠 杰 劉煥彩 王巧真 劉永新 王 箐 張雅雯 周風華 陳燕春

(濰坊醫學院生物科學與技術學院,山東 濰坊 261053)

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自噬與骨肉瘤研究進展

鞠 杰 劉煥彩1王巧真2劉永新2王 箐2張雅雯 周風華2陳燕春2

(濰坊醫學院生物科學與技術學院,山東 濰坊 261053)

自噬；骨肉瘤；自噬相關因子

骨肉瘤是一種骨髓間充質來源的原發性惡性骨腫瘤，通常發生在長骨干骺端和膝關節周圍，主要發生在青少年時期，成人呈現雙峰年齡分布。通常采取多種方式聯合治療，包括輔助化療、截肢與保肢重建手術?；熉摵鲜中g治療能夠極大提高生存率，然而超過80%的手術治療患者表現出轉移〔1〕，患者預后極差。此外，化療所帶來的毒性和副作用嚴重影響了患者的治療效果。當前自噬上調被發現存在于多種腫瘤疾病中，降低自噬可限制腫瘤生長〔2〕。因此，如何抑制骨肉瘤發展并降低治療過程的毒副作用是一個亟待解決的問題。自噬是一個受到嚴格監管的溶酶體降解途徑，在所有物種中高度保守。自噬能防止有害元件的蓄積，降解或者回收部分損傷細胞器及其他細胞產品，以保持細胞正常生長和分裂分化，維持代謝平衡及內環境穩定性〔3〕。研究表明，自噬基因的缺陷，增加了基因組不穩定性、喪失移除受損線粒體的能力進而產生活性氧，誘導腫瘤發生〔4〕。抑制自噬可提高目前使用的抗腫瘤藥物及其他療法的有效性〔5〕。本文將對自噬及自噬相關因子與骨肉瘤發生發展的關系做以下綜述。

1 高遷移率族蛋白(HMGB)1調節自噬

1.1 HMGB1 HMGB1是結合于染色質胞外損傷有關的模式分子，是一種重要的自噬調節物質〔6〕。人類的HMGB1 有215 452個氨基酸殘基組成，形成2個DNA結合域和1個C末端酸性尾巴。HMGB1在細胞核中以兩種富含賴氨酸的形式存在于A盒和B盒中，是染色質的結構蛋白，在調節核內環境和基因穩定性發揮作用，維持HMGB1 A盒的氧化還原狀態，可能會調節例如順鉑等藥物的抗腫瘤活性〔7〕。HMGB1能與核小體轉錄因子以多種可逆方式相互作用，從而調控許多基因轉錄(例如：增加組蛋白和DNA作用，造成核小體整體結構改變)〔8〕。在內源性損傷過程中，HMGB1作為信號分子參與自噬，高度乙?；腍MGB1在活性氧介導下以主動運輸的方式從受損傷細胞向胞質內轉移。核外HMGB1結合到細胞表面受體激活下游信號通路(例如：NF-κB和PI3K通路)，產生細胞黏附遷移，刺激增殖，誘導自噬等細胞學效應。研究發現，下調HMGB1可抑制癌細胞轉移，在腫瘤的發生發展中起關鍵作用，HMGB1是治療惡性腫瘤的潛在靶點〔9〕。

1.2 HMGB1調節的自噬與骨肉瘤 HMGB1有3個半胱氨酸，分別位于第23、45和106位。HMGB1的氧化促進了其定位于細胞外基質及其后的自噬過程。相比于正常組織，活性氧和自噬在癌細胞中都會發生改變〔10〕。Tang等〔11〕研究說明HMGB1向胞質轉移對于維持和促進自噬是必須的。在HMGB1的3種半胱氨酸突變形式中，對氧化敏感的是半胱氨酸的第106位(C106)突變，而不是第23位(C23)和第45位(C45)突變。在兩組獨立試驗中，C106突變體與野生型相似，然而C23和C45突變個體喪失了介導自噬的能力。因為突變的HMGB1不能結合到Beclin-1(Bcl-2作用卷曲蛋白)，無法終止Beclin-1-Bcl-2(B-cell leukemia/lymphoma 2)相互作用，Bcl-2家族的抗凋亡蛋白控制Beclin-1依賴的細胞自噬〔12〕。Piro等〔13〕研究結果也顯示，與正常的骨組織相比，骨肉瘤組織中Bcl-2的活性增加，提示Bcl-2在腫瘤發生中發揮重要作用并且可以作為腫瘤活性的診斷指標。在敲除HMGB1的骨肉瘤細胞中HMGB1和Beclin-1相互作用被抑制。多項研究結果顯示，Beclin-1基因在骨肉瘤中的表達明顯低于正常骨組織，說明自噬在骨肉瘤中發揮重要作用。HMGB1在活性氧的觸發下，轉移到細胞外基質中，胞質中的HMGB1競爭性結合Beclin-1，在C23和C45作用下破壞Beclin-1同Bcl-2相互作用，HMGB1通過控制Beclin1-Bcl-2復合體解離與結合控制自噬進程。Beclin-1同Bcl-2的解離是參與激活自噬和控制凋亡的重要機制。HMGB1與Beclin-1正相互作用由ULK(ULK)調節，負調控由P53調節〔14〕。另外，上調的HMGB1與Bcl-2競爭性結合Beclin-1，促進Beclin-1/PI3kc3復合體形成，促進細胞自噬〔15〕。HMGB1的敲除抑制了在自噬體形成過程中LC3-II的表達，并且在MG-63細胞中抑制了LC3顆粒結構的聚集。超微機構分析顯示HMGB1沉默的MG-63細胞在應用抗癌藥物后僅有幾個自噬體形成。利用P62形成的蛋白聚集會被自噬降解的特點，用P62測定自噬通量，HMGB1敲除的MG-63細胞抑制了P62降解，這些均顯示HMGB1調節的自噬在骨肉瘤發生發展中發揮重要作用〔16〕。

內源性HMGB1促進自噬進而影響藥物治療，3-甲基腺嘌呤(3-MA)是自噬的抑制劑，阻斷自噬體形成并且抑制自噬依賴的蛋白質降解，敲除Beclin-1或使用3-MA通過抑制自噬使得骨肉瘤對藥物更加敏感〔17〕。3-MA和順鉑(DDP)共同處理的MG-63細胞增殖抑制率明顯高于DDP組，說明骨肉瘤對藥物敏感性增強可能是通過下調自噬實現〔18〕。HMGB1介導的自噬也是骨肉瘤產生抗藥性的主要原因，在體內外研究中均發現HMGB1和自噬抑制都能增加骨肉瘤對藥物的敏感性。粘著斑激酶家族相互作用蛋白(FIP)200是一種ULK 結合蛋白，HMGB1和Beclin-1的相互作用需要ULK1-FIP200復合物的參與，并且促進了Beclin-1-PI3KC3復合物的形成和自噬的進展。在野生型骨肉瘤細胞株中，雷帕霉素預處理能保護阿霉素誘導的細胞凋亡，然而雷帕霉素很少保護HMGB1敲除的骨肉瘤細胞。過表達的HMGB1還能發揮抗凋亡作用。在HMGB1介導自噬研究中發現骨肉瘤耐藥性的新機制，這將為骨肉瘤耐藥性的產生提供了新的治療方法。

2 mTOR調節的自噬與骨肉瘤

在自噬的活性調節中，mTOR 是調節自噬信號途徑的關鍵信號分子，目前國內外對mTOR信號途徑在骨肉瘤中的研究報道較少。mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，mTOR 信號通路由于處于生長調節的中心環節而倍受關注。mTOR 作為自噬啟動階段信號轉導的上游調控因素，調控自噬相關基因的表達。mTOR 能夠磷酸化ULK1和ULK2，阻止自噬的發展〔19〕。當位于細胞表面的酪氨酸激酶受體(RTK)和G 蛋白偶聯受體(GPCRs)與相應的細胞外配體相結合就可以隔離磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的調節亞基并釋放催化亞基，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)磷酸化，轉變為磷酸肌醇三磷酸(PI3P)。PI3P 是一個重要的細胞內信號，可以與許多具有同源性底物的蛋白質相結合，如磷酸肌醇依賴的激酶1(PDK1)和激活的蛋白激酶B(AKT)，PDK1與PI3P 在細胞膜上結合并使AKT磷酸化，激活的AKT可以使細胞核和細胞質中許多目標蛋白磷酸化，抑制mTORC1的激活，促進自噬發生〔20〕。

PI3K/AKT/mTOR信號途徑抑制過度自噬，誘導細胞死亡，AKT是PI3K的下游效應物，mTOR是AKT的下游效應物，mTOR分為mTOR復合物1(mTOR Complex 1,mTORC1)和mTOR 復合物2(mTOR Complex 2,mTORC2)。mTORC1包括mTOR、Raptor和gβ1。mTOR和Raptor相互作用調節mTOR激酶活性〔21〕。研究發現，mTOR抑制劑與自噬抑制劑共同作用能通過抑制細胞凋亡途徑進而有效地治療骨肉瘤〔22〕。PI3K/AKT通路是mTORC1的主要調節物，在多種腫瘤細胞中參與細胞存活和抑制凋亡。激活的PI3K/AKT 參與人類骨肉瘤Saos-2 細胞系的凋亡抑制。生長因子通過PI3K活化或者AKT第473位絲氨酸殘基磷酸化〔23〕?；罨腁KT通過抑制Bcl-2第136位色氨酸殘基磷酸化導致細胞凋亡。PI3K/AKT/mTOR信號途徑抑制過度自噬，誘導細胞死亡，另一方面mTORC1能刺激受損或毒性蛋白自噬，上調細胞存活效應通過 mTORC2活化AKT〔24〕。此外，研究發現mTOR抑制物雷帕霉素靶蛋白使P62和微管相關蛋白1(MAP1)LC3水平明顯升高，P62被認為是自噬和蛋白泛素化的標志，提示雷帕霉素可激活自噬，誘導MG63細細胞凋亡〔25〕。

3 Atg4B調節的自噬與骨肉瘤

在骨肉瘤中有兩條主要自噬通路：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路和第三類磷脂酰肌醇激酶(Ptdins3K)通路〔26〕。mTOR通過刺激增強Ptdins3k的活性，抑制ULK1/2(mammalian orthologs of yeast Atg1)復合體形成。mTOR抑制劑雷帕霉素在腦膠質細胞瘤中誘導自噬介導的細胞死亡。Ptdins3K 合成三磷酸磷脂酰肌醇，在自噬體形成的過程中給自噬相關基因(Atg)提供了一個結合位點。這兩種途徑通過調節Atg4或者Atg7的活性調控微管相關蛋白1 輕鏈3B(MAP1LC3B)脂質體形成。Atg4B是LC3B的主要激活物，Atg4B對于催化LC3B羧基端裂解具有最高的催化活性〔27〕。Atg4B和LC3B對于維持和增強自噬是必不可少的。一旦LC3B羧基端的甘氨酸暴露給Atg4B，Atg7在腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)依賴性激活LC3B并傳遞給Atg3，這使得LC3B結合到磷脂酰乙醇胺，實現LC3B的脂化。脂化的LC3B錨定這些自噬蛋白形成自噬體，并通過這種方式促進膜膨脹擴張自噬體，以此提高自噬強度〔28〕。脂化的LC3B或者在自噬體內被降解或者被Atg4B切割，或者重新回收利用。Atg4B激活LC3B的脂化并且回收脂化的LC3B，使其成為游離狀態。LC3B在脂質體形成中必不可少，并且影響到自噬泡大小和沿微管的運輸〔29〕。Atg4B提供給細胞足夠的LC3B擴大自噬，并回收LC3B脂質體，維持自噬，這可能與骨肉瘤治療過程中抗藥性的產生有關。在缺乏氨基酸且沉默Atg4B的骨肉瘤細胞株中，沉默Atg4B的細胞株比對照組細胞更敏感，Atg4B對于骨肉瘤中的細胞生長有積極作用。在敲除Atg4B的Saos-2骨肉瘤細胞株中發現饑餓誘導的自噬缺陷。在缺乏氨基酸的培養基中，沉默Atg4B的Saos-2細胞死亡，在小鼠體內則表現為減緩腫瘤生長。Akin等〔30〕研究發現藥物NSC185058抗腫瘤作用與影響Atg4B功能和抑制自噬有關，高濃度的NSC185058降低了Saos-2的細胞活力，然而在缺乏Atg4B的骨肉瘤細胞株不敏感，因此認為抑制自噬作用是Atg4B抗腫瘤作用的主要機制。

4 microRNA(miRNA)調節的自噬與骨肉瘤

miRNA是長度在18～25 nt的內源性非編碼核苷酸，從線蟲到哺乳動物保持高度同源性。miRNA在后期轉錄和調控翻譯等生物學功能上發揮作用，miRNA幾乎影響所有的生物進程，進而影響基因表達和細胞生長〔31〕。研究顯示miRNA在調節細胞自噬進程中發揮重要作用，多種miRNA通過改變自噬參與骨肉瘤發生與發展。

4.1 miR-22與骨肉瘤 miR-22既可作為抑癌基因也可作為原癌基因。它在細胞生長、增殖、遷移、侵襲、衰老中起著十分關鍵的作用〔32〕。miR-22抑制核轉錄因子SPl、Sirtl(silent mating type information regulation 2 homolog 1)和CDK6(CDK6)的抗衰老作用而促進癌細胞衰老，也可抑制細胞生長、增殖和侵襲〔33〕。有研究顯示在骨肉瘤組織中miR-22表達量較正常骨組織降低，miR-22表達水平與復發、轉移也密切相關〔34〕。在轉染miR-22的骨肉瘤細胞中，HMGB1 mRNA和蛋白質水平降低。應用抗腫瘤藥物后，miR-22表達增加。過表達miR-22能夠與HMGB1的3'端非翻譯區配對，使得HMGB1表達下調，阻斷自噬〔35〕。由此miR-22調控HMGB1誘導的自噬，并且在骨肉瘤的增殖遷移發揮重要作用。過表達miR-22抑制了細胞增殖和抗腫瘤藥物處理的骨肉瘤細胞集落的形成，提示miR-22在減少骨肉瘤化療期間抗藥性產生具有異常的潛力。

4.2 miR-101與骨肉瘤 microRNA在許多細胞進程中是主要監管者，調節基因表達和包括自噬在內的生物進程。自噬的兩個主要特征是酸性小泡(AVOS)的形成和由LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的高轉化率，他們為LC蛋白的兩種主要形式，對于自噬體形成發揮作用〔36〕。有研究顯示在經過雷帕霉素處理后的骨肉瘤U-2 OS細胞株，Atg5含量明顯升高，并且LC3-Ⅱ相比于LC3-Ⅰ含量明顯增加。為了檢測miR-101提高腫瘤細胞對藥物的敏感性，Chang等〔37〕將miR-101轉染U-2 OS 細胞株，發現自酸性小泡數量明顯低于對照組，并且由LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化被抑制。自噬相關蛋白Atg5無明顯變化，其他自噬相關蛋白表達降低，且噻唑藍(MTT)還原法檢測細胞活性，發現miR-101能夠降低U-2 OS細胞活力。因此，miR-101阻斷了由化療藥物引起的自噬，進而提高了骨肉瘤細胞對藥物敏感性。研究發現，作為一種重要的自噬抑制物，miR-101能在腫瘤細胞中增強藥物誘導的細胞凋亡，抑制腫瘤的遷移侵襲能力〔38〕。在成骨肉瘤Saos-2細胞和MG-63細胞中轉染miR-101后，miR-101表達明顯上調。miR-101過表達抑制了EZH2的活性進而抑制侵襲，并且易位的miR-101明顯抑制骨肉瘤細胞遷移和侵襲能力〔39〕。林松等〔40〕用miR-101模擬物轉染MG-63細胞，發現miR-101不但對骨肉瘤細胞增殖有明顯的抑制作用，而且可促進骨肉瘤細胞凋亡，同時降低自噬相關蛋白Beclin1和LC3B的表達，提示，miR-101能通過調控自噬基因表達影響骨肉瘤細胞的增殖和凋亡。

5 結 語

HMGB1是自噬調節物質，通過影響PI3K/AKT/mTORC1途徑，在抗藥性產生過程中起重要作用。Atg4B抑制自噬發揮抗腫瘤作用，miRNA通過抑制和阻斷自噬也能減少抗藥性產生和對藥物敏感性。骨肉瘤的發病是多種原因共同作用的結果。目前病因及發病機制仍不清楚，治療方法主要集中在抗癌藥物聯合手術治療，但治療效果較差。發病機制的研究是治療骨肉瘤的基礎。若能夠深入探討自噬與骨肉瘤發病之間的關系，闡明自噬在骨肉瘤發生發展中的作用，將為治療骨肉瘤提供新的思路。若能夠通過調節自噬通路減少抗藥性產生，提高腫瘤對藥物的敏感性，將為骨肉瘤的治療提供新的希望。隨著發病機制研究的不斷深入，必定會為骨肉瘤的治療提供可能，人類在對抗惡性疾病的信心和技術是不容低估的，相信在不久的將來，骨肉瘤一定會為人類所克服。

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〔2016-02-01修回〕

(編輯 曲 莉)

國家自然科學基金(81401066)；山東省自然科學基金(ZR2012HQ021)；山東省教育廳課題(J12LK51，J13LK05)；濰坊市科學技術發展計劃項目(201301074，201302089)

1 濰坊醫學院附屬醫院 2 濰坊醫學院臨床醫學院

陳燕春(1979-)，女，副教授，主要從事神經退行性疾病及骨腫瘤方面的研究。

鞠 杰(1994-)，男，本科生，主要從事神經退行性疾病及骨腫瘤方面的研究。

R738.1

A

1005-9202(2016)23-6024-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.111