飼用乳酸菌高密度培養的研究進展

劉輝，季海峰，王四新，張董燕，王晶，單達聰，王雅民

（北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京海淀100097）

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綜述

飼用乳酸菌高密度培養的研究進展

劉輝，季海峰*，王四新，張董燕，王晶，單達聰，王雅民

（北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京海淀100097）

高密度培養是提高微生物產量的有效途徑和手段。將高密度培養技術應用于飼用乳酸菌的生產，可以大大提高生產率，降低生產成本，并且加速乳酸菌制劑的商品化進程，使其能夠更好地滿足市場需求。本文就乳酸菌高密度培養的主要影響因素及培養方式進行了綜述，為飼用乳酸菌的高密度培養提供參考。

乳酸菌；高密度培養；影響因素；培養方式

乳酸菌具有改善腸道微生態環境、增加營養物質利用率、提高動物機體免疫力等多種生物學功能。乳酸菌的生產主要通過液體培養，但由于乳酸菌對營養和培養條件要求比較苛刻，并且在生長過程中不斷消耗營養底物和產生有機酸等代謝產物，抑制了菌體自身的生長繁殖，采用常規方法培養時培養液中的活菌數一般只能達到107～109cfu/mL，較低的生物量制約了乳酸菌的工業化生產及應用。

高密度培養（HDC）是提高微生物產量的有效途徑和手段。由于不同菌種（或菌株）所能達到的最高菌體濃度相差較大，目前對高密度培養沒有確切定義，一般是指在液體發酵培養中，采用一定的技術手段和設備將菌體密度提高到常規培養數倍以上的培養技術。相對于普通培養，高密度培養的優勢在于可減少培養體積、縮短生產周期，獲得較高的目標菌體密度，減少動力消耗從而降低生產成本（Riesenberg和Guthke，1999）。乳酸菌進行高密度培養，不僅與所用的培養基有直接關系，也與培養方式密切相關，其核心技術是在保證一定營養供給的同時解除代謝產物對菌體生長的抑制，即保持穩定的比生長速率、合理的營養供給和代謝產物的去除（李寅等，2006）。

1　影響乳酸菌高密度培養的因素

影響乳酸菌增殖的主要因素包括營養物質、培養溫度、pH值、攪拌轉速、接種量、培養時間、代謝產物等。乳酸菌要通過高密度培養技術達到理想的高濃度產量，需要優化一系列相關的工藝參數，消除或減少這些因素對培養的影響。

1.1營養物質乳酸菌對營養要求復雜，正常生長需要碳源、氮源、緩沖鹽、微量元素、生長因子及水等基礎物質（Dumbrepatil等，2008）。培養基中各組分的濃度和比例要適當，特別需要注意的是碳源和氮源的比例：碳氮比若偏小，菌體生長旺盛會導致提前衰老自溶；若過大，則菌體繁殖數量低；碳氮比合適，但碳氮源濃度高，會導致發酵初期菌體大量繁殖而后期生長緩慢，代謝廢物過多引起菌體的代謝異常；碳氮比合適，但濃度過低，也會影響菌體的繁殖數量。因此，對發酵培養基各組分和比例進行優化篩選，使其能夠滿足乳酸菌的生長需要，是實現乳酸菌高密度培養的前提。柏建玲等（2007）以改良MRS培養基為基礎，選擇玉米漿、牛肉膏、乳糖、番茄汁、蛋白胨等7個營養因子進行培養基的優化。結果表明，嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌等3種乳酸菌在優化的培養基中培養，細胞密度達到109cfu/mL以上，均高于原MRS培養基的細胞密度，并且發酵培養基的成本大大降低。高鵬飛等（2008）對Lactobacillus casei Zhang的增殖培養基優化后，經37℃、18 h培養，活菌數可達到4.78×109cfu/mL，比在MRS中的活菌數（4.8×108cfu/mL）提高近10倍。

1.2培養溫度溫度通過影響細胞膜的流動性以及胞內酶的活性來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝，因此選擇適宜的發酵溫度對菌體的生長繁殖意義重大。最適生長溫度與菌株的種屬和來源、所用培養基、培養條件和菌體的生長階段等有關，一般而言，乳酸菌的最適生長溫度為25～45℃。培養溫度還會影響代謝產物的產量和質量。Gassem等（1997）認為在接種溫度較低時活菌數量增加緩慢，有利于延長乳酸菌的對數期和穩定期，從而提高如胞外多糖等次級代謝產物的產量。

1.3pH值pH對微生物的生長代謝具有重要的影響。乳酸菌生長的最適pH值一般為5.5～6.5，過高或過低都不利于菌體生長，因此需要通過試驗確定最適宜菌體快速生長和繁殖的pH值。馮鎮和張蘭威（2009）對嗜熱鏈球菌St-1進行研究時發現，當培養基中的pH穩定在6.0時，其活菌數目以及發酵的活力最高。Beal等（1989）的研究則表明，保加利亞乳桿菌生長的最佳生長pH值為5.8，嗜熱鏈球菌為6.5。

1.4攪拌轉速乳酸菌在培養過程中會迅速利用營養物質產生代謝物乳酸，并且由于菌體比重較大容易沉積到發酵液底部，因此在培養過程中應適當攪拌，使營養物質和乳酸均勻分散，菌體能夠及時利用營養物質并排出代謝產物。由于攪拌造成的剪切力對菌體的分裂生長不利，因此攪拌轉速不宜過大，應通過單因素試驗確定最佳值。

1.5接種量適宜的接種量也是保證菌體高產的重要因素。一般來說，接種量小，菌體遲緩期變長，發酵周期也相應延長；接種量大，有利于種子液中水解酶對基質的利用，可以縮短遲緩期，促進乳酸菌快速生長，但接種量過高會引起菌體過快生長，導致營養物質利用過快和代謝產物積累過多，反而不利于菌體后期生長。熊曉輝等（2004）對一株乳酸菌進行研究時發現，接種量為5%時的活菌數要高于接種量為3%和7%的活菌數。

1.6培養時間高密度培養的發酵終點判定十分重要，一般應在菌體生長達到穩定期初期時及時停止發酵，防止生長進入衰亡期影響菌體活力。為此需要考察菌體的生長曲線，通過檢測不同發酵時間的活菌數，根據測得的活菌數最大值來確定最佳培養時間。

1.7代謝產物多數乳酸菌為同型乳酸發酵，其糖酵解途徑的最終產物是乳酸。乳酸可作為一種解偶聯劑使培養基中的質子進入細胞內，降低胞內pH值，最終導致菌體停止生長。如何消除發酵過程中乳酸積累對乳酸菌生長的抑制是實現乳酸菌高密度發酵的一個關鍵問題。目前，國外正在研究通過乳酸菌的代謝途徑進行基因工程調控，以降低抑制產物的生成（Upadhyaya等，2014）。

2　乳酸菌高密度培養方式

乳酸菌高密度培養的主要方式有緩沖鹽法、化學中和法、細胞循環培養法、透析培養法、補料分批培養法和微囊化培養法等。

2.1緩沖鹽法培養基中乳酸不斷積累導致pH降低是抑制乳酸菌生長的直接原因（Goncalves等，1997）。通過在培養基中添加緩沖鹽，可調節和控制培養液的pH在一定范圍內保持相對穩定，能在一定程度上緩解乳酸造成的低pH對菌體的抑制，促進菌體生長繁殖（Schoug等，2008）。常用的緩沖鹽有磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽和碳酸鈣等。劉云鶴和何煜波（2002）對3種緩沖鹽研究發現，添加一定量的緩沖鹽對發酵乳桿菌和植物乳桿菌細胞的積累有顯著促進作用，其中以磷酸氫二鉀的促進作用最為明顯，檸檬酸三銨次之，乙酸鈉最弱。馮友軍等（2003）將10%檸檬酸鈉、5%乙酸鈉和2%丙酮酸鈉按一定比例配成復合緩沖體系，能使乳酸菌的發酵終濃度從2.22×108cfu/mL提高到1.32×109cfu/mL。由于緩沖鹽的緩沖作用有一定的范圍，發酵菌液不能達到很高的菌體濃度，而且高鹽濃度也會對乳酸菌菌體的生長產生抑制作用。

2.2化學中和法通過流加中和劑，將乳酸菌發酵過程當中產生的過量乳酸中和，維持發酵液的pH保持在菌體生長的最適pH范圍內，可以促進乳酸菌的生長。常用的中和劑有氨水、氫氧化鈉、氫氧化鈣和碳酸鈉等。不同的中和試劑對不同菌株的作用不同。Krzywonos和Eberhard（2011）認為氨水比氫氧化鈉溶液更適用于植物乳桿菌的發酵。而王艷萍等（2009）認為檸檬酸鈉比氨水更適合嗜酸乳桿菌6012的生長繁殖。化學中和法可獲得高密度的菌體，并且簡便易行，是目前應用最廣泛的一種方法，但當乳酸與滴加的堿液反應產生乳酸氨或乳酸鈉等鹽類物質的濃度到達一定的濃度時，也會抑制菌體的生長繁殖，其最高密度也只能達到109～1010cfu/mL（Mufandaedza等，2006）。

2.3細胞循環培養法細胞循環培養法是指在連續培養過程中采用沉積、離心、膜過濾（超濾、微濾膜等）等方法將流出發酵液中的菌體截留并返回到發酵罐中繼續培養，同時向發酵罐中補充新鮮培養基保持發酵液體積恒定的培養方式。這種方式結合了連續培養和超濾的優點，既可以用低濃度的培養基得到較高的細胞密度，除去培養基中的抑制性代謝產物，又可以就地分離產物，強化下游操作。劉振民（2004）采用超濾膜對德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種培養液進行了濃縮。結果表明，兩種菌的菌體均可被超濾膜有效截留，濃縮后的菌體密度可達9.79×109cfu/mL。Hayakawa等（1990）采用耐熱的無機膜錯流過濾方法對干酪乳桿菌進行培養，活菌數可達1011cfu/mL。細胞循環培養存在的問題是膜容易污染，不能實現長時間的連續操作，如何選擇合適的膜組件和克服膜污染的問題是研究的重點。

2.4透析培養法在發酵過程中，營養物質的消耗和代謝產物的積累是導致微生物生長停止的主要原因。培養時利用透析膜包裹微生物，并使外部有新鮮培養液流動的培養方法稱為透析培養法。透析培養可以有效去除培養液中有害的低分子量代謝產物，同時向培養液提供充足的營養物質供菌體利用。與細胞循環培養法相比，透析培養中的透析膜不會被阻塞，可以長時間維持其滲透性能。這種培養方式可以省去耗時的培養基優化過程，大大提高了生物量的積累。Osborne（1977）將透析培養法用于乳酸桿菌培養，獲得了1×1011cfu/mL的高菌體密度。但是，由于透析培養設備需要內嵌的透析膜或外在的透析組件、輔助泵及發酵罐等，設備投資較大，對操作技術要求較高，限制了其在實際生產中的應用。

2.5補料分批培養法補料分批培養法（又稱流加培養法）是根據菌株生長和初始培養基的特點，在分批培養的某些階段以某種方式間歇地或連續地補加新鮮培養基，使菌體及其代謝產物的生產時間延長的培養方式。其最大特點是能夠調節培養環境中營養物質的濃度，不僅避免了過高的初始營養成分濃度產生的抑制，而且可以防止營養成分被耗盡后產生的限制作用。與透析培養和細胞循環培養相比，補料分批培養不需要增添設備，只需對工藝進行改進，并且操作簡單、靈活，能夠避免分批操作的許多缺點，現已成為細菌高密度培養中最有競爭力的方式之一。補料分批培養的關鍵問題是選擇合適的補料流加策略。目前主要有兩種策略控制流加營養物：反饋補料和非反饋補料。反饋補料包括pH-stat法、DO-stat法、菌體濃度反饋法、呼吸商法等；非反饋補料可分為恒速補料、變速補料、間歇補料和指數補料等。反饋補料中，pH-stat法和DO-stat法相對簡單和便宜，因而較為常用。非反饋補料中，指數補料可以將反應器中基質的初始濃度控制在較低的水平，有效減少有害代謝物的積累，并使菌體密度以一定的比生長速率呈指數形式增加。劉振民等（2008）對保加利亞乳桿菌的補料分批培養進行了研究，結果表明：控制pH 6.0進行培養，在菌體生長的對數生長期末期進行全營養物料的連續補料，最終的菌體密度提高2個對數級，活菌數可達1.0× 1011cfu/mL。Xiong等（2012）比較了恒速補料、指數補料和分批培養對植物乳桿菌NCU116生長的影響，發現采用指數補料策略可以使菌體濃度達到9.35×109cfu/mL，遠高于其他兩種培養模式。

2.6微囊化培養法微囊化培養法是固定化技術的一種，是用一層親水性的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊內，經連續培養后囊內細胞可以達到很高的密度。乳酸菌微囊化避免了傳統懸浮發酵劑的缺點和限制，從培養基中分離細胞不需經過超濾或冷凍離心，使用普通的離心或過濾就可進行，因此大大降低了生產成本。另外，微囊化技術可以防止氧對雙歧桿菌等厭氧菌的傷害，在冷凍過程中有很好的保護作用。閆穎娟等（2014）采用微囊化技術將保加利亞乳桿菌FMG-4包裹在球狀的液芯微囊內，采用連續培養的方法進行高密度培養，菌體密度達到3.18×1011cfu/g。Doleyres等（2002）利用結凝膠固定化進行長雙歧桿菌培養，其菌體密度是細胞懸浮培養的9.5倍。

3　結語

乳酸菌的高密度培養已成為當前發酵工業的研究熱點之一，也是實現乳酸菌規模化生產的重要目標和方向。乳酸菌的高密度培養已廣泛應用于乳制品行業，而在飼料行業中的研究和應用才剛剛起步，仍有諸多技術難題尚待解決，如適合的飼用乳酸菌菌種相對較少、菌體代謝理論不完善、對發酵設備和發酵條件的要求高、工藝調控過程復雜、對生產成本控制要求較高等。隨著高密度培養技術廣泛應用于飼用乳酸菌的生產，將大大提高乳酸菌的生產效率，降低生產成本，加速飼用乳酸菌制劑的商品化進程，從而更好地滿足市場需求和提高產品在市場上的競爭力。

［1］柏建玲，莫樹平，鄭婉玲，等.乳酸菌增菌培養基的營養因子優化［J］.食品與發酵工業，2007，33（2）：79～81.

［2］馮友軍，王靜，張淑娟，等.保加利亞乳桿菌增菌條件的初步研究［J］.廣西輕工業，2003，3：10～13.

［3］馮鎮，張蘭威.不同pH值培養乳酸球菌對其發酵活力的影響［J］.中國乳品工業，2009，37（3）：16～18.

［4］高鵬飛，李妍，趙文靜，等.益生菌Lactobocillus casei Zhang增殖培養基的優化［J］.微生物學通報，2008，35（4）：623～628.

［5］李寅，高海軍，陳堅.高細胞密度發酵技術［M］.北京：化學工業出版社，2006.3～12.

［6］劉云鶴，何煜波.肉品發酵劑增殖培養基及培養條件的研究［J］.湖南農業大學學報（自然科學版），2002，28（3）：234～236.

［7］劉振民，蔣士龍，莫蓓紅.德氏乳桿菌保加利亞亞種補料分批培養研究［J］.乳業科學與技術，2008，6：263～265.

［8］劉振民.采用微濾膜濃縮乳酸菌發酵液的工藝條件研究［J］.食品與發酵工業，2004，30（10）：73～76.

［9］王艷萍，習傲登，許女，等.嗜酸乳桿菌高密度培養及發酵劑的研究［J］.中國釀造，2009，5：111～116.

［10］熊曉輝，于修鑑，熊強，等.乳酸菌發酵劑高密度培養的研究［J］.中國調味品，2004，5：17～21.

［11］閆穎娟，盧儉，周劍忠，等.基于響應曲面法的微囊化保加利亞乳桿菌高密度培養條件優化［J］.食品科學，2014，35（17）：153～159.

［12］Beal C，Louvet P，Corrieu G.Influence of controlled pH and temperature on the growth and acidification of pure cultures of Strptococcns thermophilus 404 and Lactobacillus bulgaricus 398［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1989，32： 148～154.

［13］Doleyres Y，Paquin C，Leroy M，et al.Bifidobacterium longum ATCC 15707 cell production during free-and immobilized-cell cultures in MRS-whey permeate medium［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2002，60（1-2）：168～173.

［14］Dumbrepatil A，Adsul M，Chaudhari S，et al.Utilization of molasses sugar for lactic acid production by Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii mutant Uc-3 in batch fermentation［J］.Appl Environ Microb，2008，74（1）：333～335.

［15］Gassem M A，Schmidt K A，Frank J F.Exopolysaccharide production from whey lactose by fermentation with Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus［J］.J Food Sci，1997，62（1）：171～173.

［16］Goncalves L M D，Ramos A，Almeida J S，et al.Elucidation of the mechanism of lactic acid growth inhibition and production in batch cultures of Lactobacillus rhamnosus［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1997，48：346～350.

［17］Hayakawa K，Sansawa H，Nagamume T，et al.High density culture of Lactobacillus casei by a cross-flow culture method based on kinetic properties of the microorganism［J］.J Ferment Bioeng，1990，70（6）：404～408.

［18］Krzywonos M，Eberhard T.High density process to cultivate Lactobacillus plantarum biomass using wheat stillage and sugar beet molasses［J］.Electron J Biotechn，2011，14（2）：12～18.

［19］Mufandaedza J，Viljoen B C，Feresu S B，et al.Antimicrobial properties of lactic acid bacteria and yeast-LAB cultures isolated from traditional fermented milk against pathogenic Escherichia coli and Salmonella enteritidis strains［J］.Int J Food Microbiol，2006，108（1）：147～152.

［20］Osborne R J W.Production of frozen concentrated cheese starters by diffusion culture［J］.J Soc Dairy Technol，1977，30（1）：40～44.

［21］Riesenberg D，Guthke R.High cell density cultivation of microorganisms［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1999，51：422～430.

［22］Schoug A，Fischer J，Heipieper H J，et al.Impact of fermentation pH and temperature on freeze-drying survival and membrane lipid composition of Lactobacillus coryniformis Si3［J］.J Ind Microbiol Biot，2008，35（3）：175～181.

［23］Upadhyaya B P，DeVeaux L C，Christopher L P.Metabolic engineering as a tool for enhanced lactic acid production［J］.Trends Biotechnol，2014，32（12）：637～644.

［24］Xiong H L，Chen J L，Wang H，et al.Influences of volatile solid concentration，temperature and solid retention time for the hydrolysis of waste activated sludge to recover volatile fatty acids［J］.Bioresource Technol，2012，119：285～292.

High density culture is an effective way and means to improve the production of microorganism.The high density culture technology used in the production of Lactic acid bacteria preparation would increase the product efficiency，reduce the cost of production，and accelerate the commercialization process of Lactic acid bacteria preparation to meet the market demand.This paper reviewed the main influencing factors and culture methods of high density culture，which would offer the

for the high density culture of Lactic acid bacteria preparation in feed.

Lactic acid bacteria；high density culture；influencing factors；culture methods

S816.7

A

1004-3314（2016）04-0011-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160403

北京市科技計劃（Z141100002614002）；生豬產業技術體系北京市創新團隊項目（GWZJ-2009-06）；北京市農林科學院青年科研基金（QNJJ201408）