感音神經性聾基因治療研究進展

馬　騁　阮清偉

(復旦大學附屬華東醫院　上海市老年醫學研究所，上海　200040)

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感音神經性聾基因治療研究進展

馬騁阮清偉

(復旦大學附屬華東醫院上海市老年醫學研究所，上海200040)

感音神經性聾；基因治療；內耳

感音神經性聾(SNHL)是常見的內耳疾病，由多種發病因素引起，包括外界因素和遺傳因素。外界因素，如噪聲環境、全身性疾病、化學物質、不良飲食、吸煙嗜酒和耳毒性藥物等導致噪音性、耳毒性及老年性聾。近年來，遺傳因素所致的綜合征性和非綜合征性SNHL的影響受到越來越多的關注。隨著分子遺傳學技術的不斷進步，研究人員發現許多與SNHL有關的基因，并通過各種模式生物實驗揭示這些基因導致SNHL病理生理學機制。基因治療和反義寡核苷酸是基于致聾基因，干預遺傳性和獲得性SNHL的重要治療手段。在過去20余年中，研究人員采用不同的載體和非載體系統，通過不同的給予途徑及不同的基因啟動子強度將外源性遺傳物質送到哺乳動物內耳，調節內耳細胞對應基因的表達水平和持續時間，恢復聽覺器官的結構和功能〔1〕。本文重點對SNHL基因治療進展，包括載體研究、外源基因給予途徑和時機、候選基因及基因治療存在的問題進行綜述。

1　基因治療概述

基因治療是應用DNA重組技術，將人正常功能基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正、替代基因缺陷和異常，從而達到治療疾病目的。該技術主要用于遺傳病(如腺苷脫氨酶缺陷、血友病、囊性纖維病、家族性高膽固醇血癥)和惡性腫瘤等的臨床治療。基因治療策略包括：①基因矯正治療。包括基因修正、基因置換和基因增補，其中基因增補，將正常基因整合到染色體中，補償缺陷基因功能較易實現和最為常用。②基因調控治療。藥物使被抑制基因重新表達或抑制過度表達基因的表達；基因沉默技術，導入反義核酸(反義RNA結合靶mRNA，封閉其翻譯，反義DNA結合靶DNA，封閉其復制與轉錄)，小干擾RNA(siRNA)(結合靶mRNA，使其降解)和微小RNA(miRNA)結合靶mRNA，封閉其翻譯；核酶(能自我剪切的RNA)將mRNA 進行特異剪切，形成垂頭和發夾狀，破壞其作為翻譯模板的作用。③免疫調節。導入免疫相關基因，增強免疫功能和抵抗力。④活化前體藥物。導入的“自殺基因”產生一種酶，將無毒藥物前體轉變成細胞毒性藥物，殺死受體細胞。⑤耐藥基因治療。抗藥毒性基因導入腫瘤患者體內，使患者耐受更大劑量的化療〔2〕。基因導入的方法有：①生物學方法。主要是利用逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒和單純性皰疹病毒為載體，介導目的基因進入生物細胞內，是最為常用的基因轉移方法。腺病毒是目前基因治療最為常用的載體，而逆轉錄病毒載體則應用最廣泛、轉基因效率最高〔3〕。②物理學方法，如通過裸DNA直接注射、微粒轟擊、電穿孔和微注射等。肌肉注射是目前應用最為廣泛和有效的接種途徑。③化學方法。通過磷酸鈣共沉淀、二乙氨基乙醇(DEAE)-葡聚糖轉染和脂質體轉染等使目的基因進入生物細胞。其中脂質體轉染方法簡便，可攜帶較大的DNA分子，比較安全，能轉染的細胞類型也較多，但比病毒載體的轉染效率低。對上述基因導入方法的選擇時需滿足：①轉移效率高；②對分裂或非分裂相靶細胞轉移特異性好；③能穩定地定點整合到宿主染色體上，同源重組最為理想；④能調控其適度表達，安全性較高，對人體不構成較嚴重危害；⑤易于操作。基因治療有兩條途徑:①間接體內途徑(體細胞介導的基因治療)：體外將基因導入細胞內，再將該基因修飾的細胞回輸病人體內，外源基因在體內表達，達到治療或預防的目的。該方法的優點是較安全，效果易控制；缺點是技術復雜，難度大，不易推廣。②直接體內途徑：外源基因直接導入體內有關的組織細胞，使其進入相應的細胞并表達。優點是操作簡便，易推廣；缺點是療效持續時間短，免疫排斥和安全性低等。截至2012年，基因治療主要處于Ⅰ期試驗階段(占60.2%)，選擇載體種類的前三位的是腺病毒(23.3%)、逆轉錄病毒(20.0%)和裸/質粒DNA(18.5%)。疾病的種類主要是癌癥(64.7%)、單基因疾病(8.5%)，而神經科學疾病只有2%，且主要是帕金森病等中樞神經退行性變病。

2　SNHL基因治療的候選基因

人類基因組學的研究進展，至今已鑒定60余個SNHL致病基因，這些基因將是基因治療可能的靶點。特別是單基因性聾可表現為早期出現，或遲發型聾，顯性或隱性，綜合征或非綜合征等多種耳聾類型，是基因治療最為理想的候選基因。已知的基因屬于不同的基因家族，包括轉錄因子，如產生反應氧有關的N-乙酰基轉移酶2(NAT2*6A)轉錄因子粒狀頭樣(GRHL)2〔4〕；小鼠無調同源(Math)1 基因是基因轉錄的調控因子，在毛細胞分化過程中起正相調控作用〔5〕。Kawamoto等〔6〕在豚鼠內耳導入Math1基因，Math1基因過表達后，在大上皮嵴區域有新的毛細胞出現，且發現有神經纖維在新生毛細胞的誘導下向其底部生長。在耳聾豚鼠內耳Math1基因過表達后會出現毛細胞再生，并伴有部分聽力功能恢復〔7〕。C57小鼠毛細胞靜纖毛功能相關的基因Cadherin23突變，將引起年齡相關的、快速的高頻聽力下降；許多Cadherin23的修飾基因和位點，如位于小鼠10號染色體Ahl1、位于小鼠5號染色體上的Ahl2基因和小鼠17號染色體的Ahl3等均能增加SNHL的易感性〔8～10〕。離子通道，如編碼電壓依賴的鉀(Kv7.4)通道的KCNQ4〔11〕。轉運子，如編碼陰離子(氯離子/碘)轉運子跨膜蛋白pendrin 的SLC26A4〔12〕。細胞外基質分子，如聽覺上皮支持細胞間，耳蝸外側壁連接組織間縫隙連接基因connexin突變誘導非綜合征性聾，縫隙連接蛋白編碼基因31(GJB3)基因突變會造成GJB3的細胞外區結構改變〔13〕。

其他的增加SNHL易感性基因還包括氧化應激相關的基因，如谷胱甘肽S轉移酶(GST)，約50%以上的高加索人群是GST多態性(GSTM1)無義突變的基因型，這些個體高頻耳聲發射顯示較低的振幅，易于遭受氧化應激損傷，因而更易出現聽覺損傷〔14〕。N-乙酰化酶(NAT)涉及外源性毒性的調節，NAT基因遺傳變異將增加氧化應激和外源性侵襲的易感性。編碼NAT2酶基因在人群中分為快速的、中等和慢“乙酰化”表型，與聽覺衰老相關〔15〕。多次實驗驗證mtDNA4977 的缺失與老齡化有關。線粒體12S rRNA由mtRNA含鳥嘌呤(G)的重鏈編碼，最新研究顯示，其基因突變能引發綜合征型耳聾和非綜合征型耳聾〔16〕。

Fukui等〔17〕通過實驗發現，腦源性神經營養因子(BDNF)的基因轉入能夠在幾乎所有神經元都退化的Pou4f3缺失的小鼠中增強聽覺神經元的保護。在目前已有的實驗案例中，在毛細胞缺失的情況下，殘存的神經元依然表現出明顯的神經纖維的生長至聽覺上皮組織的現象。由此推斷，這種神經生長和再生可能能夠改善耳蝸植入治療對于患有遺傳性耳聾患者的療效。過度表達X連鎖的凋亡蛋白的抑制物(XIAP)能明顯減輕噪音損傷和延緩老年性聾的發生〔18，19〕。

siRNAs是RNA干擾(RNAi)過程中的效應分子。siRNA雙鏈與誘導沉默復合物(RISC)結合后裂解為siRNA單鏈，與siRNA單鏈完全互補結合的同源性靶mRNA被RISC剪切降解，從而達到基因沉默的目的。miRNAs是一類非編碼小分子RNA，具有和siRNAs相似的功能，調節細胞內基因表達。其長度為19～25 nt。它通過與mRNA 上的靶位進行堿基互補配對使其目標mRNA出現降解或者翻譯抑制現象〔20〕。miRNAs通過這種方式在人體各種發育和生理過程中起著重要的調節作用。目前已有研究表明，不同的調節蛋白在耳蝸形態的形成及其組織結構的形成中都發揮著重要作用，這些蛋白的表達和其之間的相互作用操縱著前體細胞分化，并調控其精確的發育過程〔21，22〕。研究表明，miRNAs在這種耳蝸的發育過程中同樣發揮著重要作用〔23〕。在敲除大腦miRNAs加工過程中的一種重要酶Dicer的小鼠中，出現了毛細胞排列異常、耳蝸螺旋數減少及內耳畸形等異常現象，實驗組也表現出輕微平衡障礙和聽力喪失〔24〕。目前對于miRNAs調控耳蝸發育的分子機制尚未明確，待其機制明確后，miRNA治療耳聾應當具有可行性。

Riazuddin等〔25〕通過基因分析發現非綜合征耳聾和尤塞綜合征1型耳聾的致病基因——CIB2蛋白。尤塞綜合征是一種因基因缺陷而導致耳聾及由視網膜色素變性引起的視覺逐步減退的疾病。在小鼠中，CIB2蛋白存在于內耳毛細胞的感覺靜纖毛、視網膜光感受器及色素上皮細胞，同鈣結合的分子建模預測相同，CIB2顯著減少異源性細胞中由三磷酸腺苷(ATP)誘導的鈣離子反應，改變非綜合征耳聾中的基因突變對鈣離子反應的影響。此外，在斑馬魚和果蠅中，CIB2在毛細胞和視網膜感光細胞的功能和正常發育方面也是必不可少的。

3　SNHL基因治療的給予途徑和時機

內耳存在與血腦屏障相似的血耳蝸屏障，大大降低全身給予基因載體到達內耳的效率。在基因治療應用的實現方面，還應注意基因導入內耳的不同方式，從而確定最簡單有效的基因導入方法。研究發現，通過轉基因載體將小鼠所需的基因以顯微注射的方法導入圓窗膜內的內耳，完整的圓窗途徑對耳蝸的損傷小，在臨床上有較好的發展前景〔26〕。同樣的方法也可以用于某些藥物如生長因子、抗氧化劑的治療，使其通過迷你泵顯微注射至內耳〔27～29〕。然而，經圓窗膜途徑進行基因轉染并不是轉染效率最高的途徑，這主要是由于在鼓階與中階之間還存在細胞和緊密連接組成的基底膜。其他的導入途徑還包括：耳蝸解剖后經鼓階和前庭階導入外淋巴中、經中階導入內淋巴液中、經內淋巴囊導入等，其中，經耳蝸切除和鐙骨底板途徑，中階導入比圓窗途徑導入具有更高的轉染效率〔1〕。

基因治療的一個關鍵點在于實現毛細胞的再生，由此恢復聽力。聽覺損傷后，其病理可分為四個階段：①毛細胞纖毛損傷階段。此階段毛細胞依然具備正常的生理特性，也是基因治療介入的最好時機，毛細胞能夠在纖毛再生或完全修復的基礎上使其部分甚至全部功能恢復正常〔30，31〕；②毛細胞損傷，神經纖維和支持細胞幾乎沒有損傷。此階段為基因治療的關鍵時機，在此階段導入Math1基因能夠取得較好的效果〔32〕；③毛細胞嚴重損傷，神經纖維和支持細胞同樣出現嚴重損傷。此階段單個基因導入效果不佳，應考慮Math1基因聯合其他多個因子導入，也可考慮導入干細胞〔33，34〕；④毛細胞、神經纖維及支持細胞嚴重損傷甚至消失。此階段基因導入治療將沒有效果。

4　SNHL基因治療的載體研究

SNHL基因治療需要安全可靠且高效的基因載體。實驗研究常用的基因載體包括病毒載體和非病毒基因載體。病毒載體是體內和體外基因導入能力最強的工具。有6種病毒家族經基因工程改造后用于體內和體外內耳基因轉染的載體，如腺病毒、腺相關病毒、慢病毒、皰疹病毒、痘苗病毒和仙臺病毒〔1，35～37〕。病毒載體的主要優勢是較高的轉染效率和不同的細胞靶向能力，從而限制特定的細胞亞群的轉基因表達。主要缺陷是具有潛在的免疫學和遺傳學毒性，引起炎癥和基因插入性突變。腺病毒載體是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，適用于腫瘤基因治療，體內基因治療及疫苗等。其優點在于能夠有效感染多種處于分裂期和有絲分裂后期的細胞，且制作簡便易于培養，能夠對靶基因長期并且高水平的表達，具有較強的植入能力；其缺點在于表達時間短，容易引起機體的抗病毒反應，致使細胞溶解。腺相關病毒載體是細小病毒家族中的一種復制缺陷型病毒，是一種單鏈DNA，適用于遺傳病及慢性疾病的基因治療。腺相關病毒同樣能感染處于有絲分裂后期的細胞，且表達時間較長，較少出現免疫反應；缺陷在于基因植入的空間有限，可能會發生細胞融合。慢病毒載體是一種基于人類免疫缺陷病毒(HIV)的單鏈DNA病毒，不僅能有效地作用于分裂期的細胞，也能有效地作用于非分裂期的細胞，具有較好的轉導效率、較強的植入能力和較低的免疫反應概率；缺點為易發生隨即融合。皰疹病毒載體是一種由二十面體外殼和一個包膜包圍的復雜雙鏈DNA病毒，具有較大的基因容量和較好的神經親和性，病毒滴度高，不易發生融合；不足之處在于轉導效率較低，易出現基因重組。痘苗病毒載體是一種線性的雙鏈DNA分子，同樣具有較大的基因容量，但僅限于非小痘疫苗接種的個人。仙臺病毒載體是一種單鏈RNA病毒，具有良好的轉導效率，能快速被細胞吸收，但其基因植入空間有限〔1〕。

非病毒載體指通過自然或合成復合物，如DNA、蛋白質、多聚物或脂質體混合物能形成顆粒，有效地將基因導入細胞。該類系統進一步分為：①物理方法(無載體基因導入)，如陽離子脂質體、聚陽離子非脂質體。②化學方法(合成載體基因導入)包括電穿孔和基因槍等。非病毒載體是病毒載體簡單、安全和更為靈活的替代工具。有實驗研究用非病毒材料，如陽離子復合物作為載體，與質粒DNA，股寡核苷酸等結合形成納米粒，能夠模擬類似病毒的結構，使基因正常導入〔38〕。納米粒聚合物作為基因載體進行基因轉入的優勢在于：①納米粒能夠保護核苷酸，使其不受核酸酶的作用而發生降解；②較強的生物親和性能使其與靶向分子特異性耦聯，實現基因的特異性治療；③無毒性和免疫原性，代謝產物較少，不發生免疫排斥反應；④能夠延長作用時間，維持核苷酸的濃度，有效提高生物利用率〔36〕。殼聚糖是甲殼素去乙酰化的產物，具有較好的生物相容性，能夠在人體內代謝溶解，且其分級代謝產物對人體無毒害作用〔39，40〕。殼聚糖除能維持DNA的穩定，還能保護細胞膜及DNA不受溶酶體影響發生降解。因此殼聚糖可以用于制作基因導入的載體，并能有效提高轉染率。目前已有實驗成功使用殼聚糖作為載體導入Math1基因，其在臨床治療耳聾方面的應用尚待進一步研究。非病毒載體技術似乎更為廣泛地用作基因功能鑒定的基礎研究。基于這些技術在體低的轉染效率、缺乏細胞特異性、表達時間短及細胞毒性，目前發展為基因治療載體可能性不大。

5　SNHL基因治療存在問題及前景

基因治療已取得很大進展，為遺傳病和腫瘤的治療提供一種新手段，但仍面臨一些關鍵問題。①有效的特異目的基因太少。SNHL是由遺傳和環境多因素共同作用引起，不像單基因遺傳病，在特定治療基因的選擇上十分困難。SNHL更多的可能源于多基因、多突變的累積效應復雜性遺傳疾病，至今仍然有大約70%的耳聾病因尚不清楚。②基因運載的高效性。缺乏高效的載體系統，逆轉錄病毒不能感染非分裂細胞。非病毒載體在體轉染耳蝸內細胞效率過低。③基因運載的靶向問題。如感染正常細胞，可能改變其功能。④目的基因在體內表達時效性難以有效控制。除腺相關病毒能定點整合到細胞基因組外，逆轉錄病毒盡管能整合到分裂細胞基因組，但是隨機性的；而其他病毒載體不能整合到細胞的基因組中。⑤導入基因的穩定性有待進一步研究。⑥導入外源基因對機體的影響。如腺病毒具強的免疫原性，腺相關病毒具有中度的免疫原性。單純性皰疹病毒能靶向神經組織，但具有細胞毒性〔1〕。

盡管如此，基因治療在聽覺系統基礎研究領域仍然是十分重要的研究工具。當缺乏能在時間和空間上控制特定基因的過度表達或沉默的合適的小鼠模型時，通過內耳局部的基因轉染，在不影響其他組織的前提下同樣可達到研究內耳發育、細胞生存和再生過程中單個基因的功能。在病毒載體方面，腺相關病毒是臨床病人實驗中最有潛力的基因治療載體，比其他病毒載體具有更高的轉染毛細胞和神經節的效率。非病毒載體系統轉染內耳細胞的量及選擇性都還不足以用于基因治療。在未來的研究中，應該更加深入地研究內耳毛細胞損傷及其損傷后再生的機制和過程，通過單基因導入或聯合多基因導入，篩選出對聽覺損傷起到有效恢復作用的基因。此外，在保證安全的情況下，研發出對SNHL基因治療的高效基因載體。其中，納米顆粒載體是一個很好的研發方向，其對于很多外源性和內源性的內耳疾病可能會展現出較大的優勢。

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〔2015-01-27修回〕

(編輯王一涵)

阮清偉(1965-)，男，主任醫師，博士,主要從事衰老與認知功能損害研究。

馬騁(1989-)，女，碩士，主要從事衰老與認知功能損害研究。

R764.43+1

A

1005-9202(2016)15-3848-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.112