祛風清熱通絡法對三叉神經痛大鼠三叉神經節痛覺信號傳導途徑的影響

吳遠華 司凱隆

(貴陽中醫學院第一附屬醫院，貴州 貴陽 550002)

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祛風清熱通絡法對三叉神經痛大鼠三叉神經節痛覺信號傳導途徑的影響

吳遠華 司凱隆1

(貴陽中醫學院第一附屬醫院，貴州 貴陽 550002)

目的 探討三叉神經痛大鼠模型三叉神經節痛覺信號傳遞機制及以祛風清熱通絡法為核心治療本病的作用途徑。方法 采用祛風清熱通絡法，運用慢性縮窄環法制作三叉神經痛大鼠模型，造模成功后進行動物模型三叉神經節離體培養，采用實時定量PCR法檢測三叉神經節降鈣素基因相關肱(CGRP)mRNA，探討該法對動物模型三叉神經痛覺信號傳遞機制的干預作用。結果 各組三叉神經節CGRP mRNA表達量依次為空白組<高劑量組<卡馬西平組<中劑量組<陰性對照組<低劑量組，高、中劑量組與陰性對照組相比CGRP mRNA表達下調明顯(P<0.05)；高劑量苗藥對三叉神經節CGRP mRNA表達的抑制作用較卡馬西平強，但差異不顯著(P>0.05)。結論 高劑量苗藥能下調CGRP mRNA表達，可能是通過影響CGRP的合成和釋放使CGRP含量減少，從而使三叉神經節痛覺信號傳導途徑受阻而起到緩解疼痛的作用。

三叉神經痛；三叉神經節；痛覺信號傳遞；祛風清熱通絡法

苗藥血飛蓽茇定痛湯方藥制劑由見血飛(飛龍掌血)、蓽茇、苕葉細辛、白芷、全蝎、蜈蚣、大血藤、川芎、赤芍、白芍、炙甘草組成，具有祛風清熱通絡之功效，常用來祛瘀止痛等。原發性三叉神經痛以氣血失調，肝胃郁熱，釀生風火，氣血逆亂為發病的主要機制。本研究擬以祛風清熱通絡法為核心治法對三叉神經痛模型大鼠展開實驗研究，探討該法對模型動物三叉神經節痛覺信號傳遞的影響，為治療三叉神經痛提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物、試劑及儀器 苗藥血飛蓽茇定痛湯方藥制劑由貴陽中醫學院第一附屬醫院中藥制劑室提供。苗藥配方：見血飛(飛龍掌血)、蓽茇、苕葉細辛、白芷、全蝎，蜈蚣、大血藤、川芎、赤芍、白芍、炙甘草。紫外分光光度計；PCR擴增儀；CGRP基因引物和探針；RNA提取及逆轉錄試劑；DNA擴增試劑及標準品等。

1.2 實驗動物的選擇、分組及給藥方法 選擇健康成年雄性SD大鼠多只，平均體重(250±20)g。術前測定疼痛閾值(作為基礎痛閾)后，行左側眶下神經-慢性縮窄損傷環扎術。在手術第14天開始觀察是否出現痛覺超敏癥狀，出現了痛覺超敏癥狀者將作為入選對象。入選后的大鼠根據完全隨機分組原則進行分組：正常空白組：自然環境、普通飼料飼養，以生理鹽水灌胃，每日1次，灌胃14 d。陰性對照組：測定術前疼痛閾值(作為基礎痛閾)后，進行左側眶下神經(ION-CC)環扎術制作三叉神經痛大鼠模型，通過對環扎線標記比較其松緊度及手術線的選擇等優化選擇造模方法的指標，選出最優造模方案。造模成功后以生理鹽水灌胃，每日1次，灌胃14 d。治療組：造模成功后給予血飛蓽茇定痛湯灌胃，高、中、低劑量分別按成人臨床用藥劑量的20倍、10倍、5倍計算，每日1次，灌胃14 d。陽性對照組：造模成功后給予卡馬西平治療，相當于成人劑量的10倍，每日1次，灌胃14 d。

1.3 大鼠三叉神經節離體培養模型的建立 三叉神經痛大鼠模型造模成功14 d后，麻醉后用750 ml/L酒精浸泡3 min，然后進行消毒，再行斷頭處死，用止血鉗沿枕骨大孔端層層剝開顱骨和顳骨并刮掉大腦、小腦，充分暴露三叉神經，輕輕剪斷三個感覺根取出神經節，將神經節取出并放在冷的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)中，慢慢將周圍的脂肪、血管、神經鞘膜等結締組織從神經節中剔除，變成乳白色，保存在4℃PBS中備用。24孔培養板內每孔盛2 ml DMEM(Sigma，USA)培養液(加青霉素100 U/ml，鏈霉素100 mg/L以及兩性霉素B 25 mg/L)。放置在37℃恒溫培養箱中培養，持續給予含50 ml/L CO2O2，把pH值維持在7.4，每24 h更換1次培養液。

1.4 實時定量PCR檢測降鈣素基因相關肽(CGRP)mRNA表達量 用FastPrepA試劑盒(QBIOgene，CA，USA)中1 ml RNA proTM液(Q-BIOgene，CA，USA)勻漿進行處理組織，按程序提取總RNA。采用1%普通瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA。cDNA的逆轉錄采用Gene Amp RT試劑盒(PE Applied Biosystems)。Real-time PCR使用GeneAmp SYBR Green PCR試劑盒(PE Applied Biosystems)，Perkin-Elmer PCR儀(PE，GeneAmp 5700)。管家基因GAPDH：上游引物：5′-GGCCTTCCGTGTCCTACC-3′，下游引物：5′-AGGTGTTGGTGCTGGACACA-3′，引物長度55 bp。CGRP(M34090)：上游引物：5′-GAGGCAGCTACAAGGTTCAGG-3′，下游引物：5′-CGGCATGTCAGATCCACAAC-3′，引物長度151 bp。PCR反應體系為50 μl，先50℃ 2 min，95℃ 10 min，再95℃ 15 s和60℃ 1 min，共循環40次，待反應結束，采用分離曲線進行分析，確定反應產物的特異性。定量數據分析采用PCR循環閾值(Cycle threshold，Ct)，用GAPDH的Ct值作為內對照，計算CGRP mRNA的相對表達量。標準曲線根據Ct=1 g〔濃度/(1+E)〕方程繪制，代表擴增效率，根據標準曲線的斜率計算，理想斜率=3.3，理想擴增效率=100%。標準曲線驗證CGRP和GAPDH的cDNA在PCR反應體系里擴增效率相同。

1.5 統計學方法 應用SPSS19.0軟件行單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1 總RNA濃度 用紫外分光光度計測定各組樣本RNA的260 nm、280 nm波長OD值，OD260/OD280比值為1.8～2.0，提示RNA純度較好，無明顯污染。

2.2 三叉神經節中CGRP mRNA表達水平 高劑量組三叉神經節CGRP mRNA表達量(0.294 8±0.003 2)最低，其余造模組均高于高劑量組，依次為：陽性對照組(0.295 5±0.000 4)<中劑量組(0.316 5±0.003 0)<陰性對照組(0.331 8±0.004 0)<低劑量組(0.344 7±0.003 5)<空白組(0.353 2±0.004 5)；高、中劑量組與陰性對照組相比，CGRP mRNA表達下調明顯(P<0.05)；高劑量苗藥對三叉神經節CGRP mRNA表達的抑制作用較卡馬西平強，但差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

原發性三叉神經痛的原因尚未明確，臨床表現為三叉神經分布區短暫而反復發作的劇烈性疼痛。三叉神經痛屬祖國醫學中“面痛”、“頭風”等范疇〔1〕。《張氏醫通》云，面痛皆因于火，而虛實之殊。張運凱等〔2〕提出：三叉神經痛總厥陰少陽，陽明，肝膽風火，腸胃燥熱，閉阻經絡，脈滿腫脹，迫及神經而劇痛突然發作。我國對三叉神經痛的研究大多數為臨床分析，有研究指出運用苗藥治療原發性三叉神經痛取得好的療效〔3〕，但對其發病機制，特別是苗藥的作用機制方面研究較少。

CGRP作為一種生物活性多肽，主要存在于三叉神經節和背根神經節等部位〔4〕，具有強烈的擴血管作用，能增加毛細血管通透性血漿蛋白的滲出。CGRP主要是通過cAMP-PKA-MEK-ERK-CREB信號轉導途徑參與疼痛過程。本研究發現，相對于陰性對照組而言，高劑量組對三叉神經節CGRP mRNA表達的抑制作用較強。原因可能是苗藥中的成分如大血藤、見血飛、苕葉細辛等達到一定濃度后，可通過多種途徑干擾CGRP合成，使得CGRP發出抑制信號，降低CGRP的合成量，阻滯了cAMP-PKA-MEK-ERK-CREB信號的傳導。同時，有文獻指出，在感覺神經節中CGRP與背角P物質(SP)共存，SP作為一種傳遞傷害性刺激信息的神經遞質，能增加傷害性信息的傳導〔5，6〕。在痛覺傳導過程中，CGRP能增加SP的釋放，增強了痛覺信號的傳導〔7〕；加上CGRP抑制SP的降解酶，延長了SP的作用時間，進一步加強了痛覺信號的傳遞〔8〕。而苗藥中各成分可能降低CGPR的表達，減少SP的釋放，在一定程度上激活SP降解酶，使SP在量上和活性上都可能降低，阻滯了痛覺信號傳導通路的傳遞。還有一種可能的原因是苗藥中各種成分的濃度較高，與CGRP競爭結合位點的可能性增加，減少CGRP與相應位點的結合，CGRP不能結合而被降解。

卡馬西平是治療三叉神經痛的一線藥，卡馬西平會給患者帶來頭昏、嗜睡、共濟失調、皮炎等副作用〔9〕。一定劑量的苗藥可以降低CGRP mRNA的表達量，緩解三叉神經痛。提示在治療三叉神經痛時可以考慮一定劑量的苗藥和一定劑量的卡馬西平聯合使用，既能減少卡馬西平的使用量、降低卡馬西平的副作用，又能增加療效、緩解疼痛。

1 張美增，郭瑞友，王 嶺.中西醫結合神經病學〔M〕.北京：科學技術文獻出版社，2014：212-3.

2 張運凱，趙錫武.偏頭痛方治療三叉神經痛5例〔J〕.湖北民族學院報，2004；21(2)：35-6.

3 吳遠華，邵 勇，朱廣旗，等.血飛蓽茇定痛湯治療原發性三叉神經痛34例〔J〕.陜西中醫，2010；31(8)：1006-7.

4 鄭林豐，謝應桂，許愿忠.降鈣素基因相關肽在神經系統損傷中的作用〔J〕.創傷外科雜志，2006；8(6)：571-3.

5 Hutchins B，Spears R，Hinton RJ，etal.Calcitonin gene-related peptide and substance P immunoreactivity in rat tri-geminal ganglia and brainstem following adjuvant-induced inflammation of the temporomandibular joint〔J〕.Arch Oral Biol，2000；45(4)：335-45.

6 黃 飛，張 敏，張 曼，等.心理應激對大鼠三叉神經節降鈣素基因相關肽表達的影響〔J〕.口腔醫學研究，2008；24(6)：619-21.

7 Ghatta S，Nimmagadda D.Caleitonin gene-related peptide：understanding its role〔J〕.Indian J Pharmacol，2004；36(5)：277-83.

8 朱遵燕，楊曉秋.三叉神經慢性縮窄環術大鼠血降鈣素基因相關肽及P物質變化〔J〕.解放軍醫學雜志，2011；36(4)：376-8.

9 何俐鈞，余建萍.奧卡西平與卡馬西平治療原發性三叉神經痛的療效及副作用比較〔J〕.中國老年學雜志，2012；32(21)：4786-7.

〔2015-11-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

貴州省科學技術基金項目(黔科合J字〔2011〕2303號)

司凱隆(1989-),男，住院醫師，主要從事中西醫結合治療神經性疼痛的研究。

吳遠華(1976-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事中西醫結合治療腦血管病研究。

R745.11

A

1005-9202(2016)22-5517-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.010

1 貴陽中醫學院