1株馬源致病性蠟樣芽孢桿菌的分離與鑒定

王玉田 ， 王承民 ， 劉艷華 ， 何宏軒 ， 金銀姬 ， 劉 鑫 ， 白 煦 ， 李志衍 ，鄭瑞峰

(1.北京市畜牧總站 ， 北京朝陽(yáng)100107 ； 2中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所 ， 北京朝陽(yáng)100101 ；3.北京農(nóng)道眾聯(lián)農(nóng)業(yè)科技有限公司 ， 北京海淀100086 ； 4.中國(guó)馬業(yè)協(xié)會(huì) ， 北京朝陽(yáng)100125)

1株馬源致病性蠟樣芽孢桿菌的分離與鑒定

王玉田1， 王承民2， 劉艷華3， 何宏軒2， 金銀姬1， 劉 鑫1， 白 煦4， 李志衍1，鄭瑞峰1

(1.北京市畜牧總站 ， 北京朝陽(yáng)100107 ； 2中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所 ， 北京朝陽(yáng)100101 ；3.北京農(nóng)道眾聯(lián)農(nóng)業(yè)科技有限公司 ， 北京海淀100086 ； 4.中國(guó)馬業(yè)協(xié)會(huì) ， 北京朝陽(yáng)100125)

蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)是革蘭陽(yáng)性需氧產(chǎn)芽孢桿菌，一種廣泛分布于土壤、水、空氣、飼料、食品和環(huán)境中產(chǎn)芽孢桿菌。該菌為條件致病菌，容易污染食物和飼料，也可引起牛乳房炎、子宮內(nèi)膜炎，但還未見(jiàn)馬感染該菌的報(bào)道。

2015年5月，北京市某馬術(shù)俱樂(lè)部賽馬皮膚下有直徑2～3 cm大小的膿腫結(jié)節(jié)。結(jié)節(jié)逐漸增大，突起于皮膚表面，變成膿腫，然后破潰流出黃白色或淡紅色膿液，逐漸形成潰瘍。潰瘍高于皮膚表面如蘑菇狀或周?chē)黄鹬虚g凹陷，易于出血，不易愈合。潰瘍不斷地分泌出膿性分泌物，使病灶附近的毛粘結(jié)成痂皮,檢測(cè)內(nèi)容和結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 (1)膿汁：對(duì)沒(méi)有破潰膿包皮膚用碘酊和75%醫(yī)用消毒酒精消毒，用無(wú)菌注射器吸取或用消毒棉簽蘸取膿汁，放入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中；(2)血液：前腔靜脈無(wú)菌采集靜脈血5mL，注入血液增菌培養(yǎng)基中。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定 營(yíng)養(yǎng)肉湯和血液培養(yǎng)基37℃厭氧和需氧培養(yǎng)48h增菌；將膿汁樣本涂抹于新鮮血液和巧克力瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)；用革蘭染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)，多次分離純化，得到純化細(xì)菌[1]。接種各種糖發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)，淀粉水解試驗(yàn)、D-阿拉伯糖試驗(yàn)、青霉素抑制試驗(yàn)、觀察生化反應(yīng)特性[2]。

1.3 細(xì)菌16S rDNA 的檢測(cè) 取分離到細(xì)菌的DNA作為模板，用細(xì)菌菌種鑒定通用引物(7F:5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’, 1540R:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’；27F:5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’,1492R:5’-GGTTA-CCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交GenBank，并與其他芽孢桿菌進(jìn)行比對(duì)，確定16S 基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)特征 經(jīng)鮮血瓊脂培養(yǎng)基和巧克力瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好。菌落淺灰色，毛玻璃狀，伴有草綠色溶血和透明溶血環(huán)。在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上呈明顯β型溶血(見(jiàn)中插彩版圖1A)。菌體兩端鈍圓，單個(gè)或長(zhǎng)鏈狀排列，無(wú)莢膜，有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。芽孢呈橢圓形，位于中央或近端。革蘭染色呈陽(yáng)性，可形成芽孢(見(jiàn)中插彩版圖1B)。

2.2 細(xì)菌16S rDNA 分析 芽孢桿菌群成員有13 個(gè)基因型，根據(jù)16 S rDNA 序列差異性分析，確定該菌株16 S rDNA 序列(GenBank 登錄號(hào)為JX294967)為蠟樣芽孢桿菌群(見(jiàn)圖2)。

2.3 生化特性、藥敏試驗(yàn) 該菌株能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，不發(fā)酵乳糖、木糖、甘露醇和果膠糖。過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)(M.R.)和乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V-P)為陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)和硫化氫試驗(yàn)為陰性。青霉素抑菌試驗(yàn)陰性，在高濃度處生長(zhǎng)，排除炭疽桿菌[3]。對(duì)青霉素、氨芐西林、頭孢菌素耐藥；對(duì)克林霉素、紅霉素、磺胺類(lèi)藥物敏感。分離菌生化特性符合蠟樣芽孢桿菌

3 討論

3.1 通過(guò)病原檢測(cè)，可以判定為蠟樣芽孢桿菌感染，引起皮膚產(chǎn)生膿皰，破潰導(dǎo)致出現(xiàn)的淋巴脈管炎。病馬由皮膚傷口感染，經(jīng)淋巴及血液循環(huán)引起全身菌血癥。通過(guò)文獻(xiàn)檢索，該菌是人醫(yī)骨科創(chuàng)傷感染的常見(jiàn)菌，導(dǎo)致創(chuàng)面均有紅腫、滲出和膿性分泌物。與本病例癥狀相符，但是在國(guó)內(nèi)在馬上沒(méi)有報(bào)道，需引起臨床獸醫(yī)注意。

3.2 馬傳染性脈管炎是由偽皮疽組織胞漿菌引發(fā)的疾病，是真菌感染性疾病。通過(guò)涂片鏡檢及培養(yǎng)結(jié)果為陰性。應(yīng)用大劑量抗生素克林霉素治療，傷口處涂抹磺胺粉，經(jīng)15 d治療后治愈。

[1] GB4789.14—2014, 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)[S].

[2] 尚紅,王毓三,申子瑜.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2015:667-668.

[3] NY/T 561—2015,動(dòng)物炭疽診斷技術(shù)[S].

2016-08-04

王玉田(1971-)，男，高級(jí)獸醫(yī)師，本科，從事動(dòng)物疫病診治工作，E-mail:646795388@qq.com

鄭瑞峰，E-mail：1138028814@qq.com

S852.6

B 文章標(biāo)號(hào)：0529-6005(2016)11-0052-02