WNK1激酶對Maxi K通道的調節作用

施珍，周麗娜，張益前，王德選，莊捷秋

（1.溫州醫科大學附屬第二醫院 腎內科，浙江 溫州 325027；2.溫州市人民醫院 腎內科，浙江 溫州325000；3.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 兒童腎內科，浙江 溫州 325027）

?論 著?

WNK1激酶對Maxi K通道的調節作用

施珍1，周麗娜2，張益前1，王德選3，莊捷秋3

（1.溫州醫科大學附屬第二醫院 腎內科，浙江 溫州 325027；2.溫州市人民醫院 腎內科，浙江 溫州325000；3.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 兒童腎內科，浙江 溫州 325027）

目的：研究WNK1激酶對Maxi K通道的調節作用。方法：將攜帶WNK1和Maxi K目的基因的質粒DNA轉染在HEK-293T細胞上，分別應用細胞免疫熒光染色、Western blot觀察WNK1對Maxi K在細胞上分布及總蛋白表達水平的影響。結果：免疫熒光染色發現實驗組的Maxi K在細胞上的分布明顯增多。Western blot結果顯示，與對照組相比，實驗組1和實驗組2的Maxi K總蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.01）；與實驗組1相比，實驗組2的Maxi K總蛋白表達水平亦明顯升高（P＜0.05）。結論：WNK1能上調Maxi K的總蛋白表達水平，且隨著WNK1 DNA劑量的增加，上調作用逐漸增強，顯示其上調作用具有劑量依賴性。

WNK1；Maxi K；假性醛固酮減少癥Ⅱ型；高血壓

高血壓是冠心病、腦卒中等眾多心血管疾病最大的獨立危險因素。高血壓的發病機制非常復雜，包括遺傳和非遺傳因素。其中一些離子通道和轉運體在高血壓發病機制中的作用逐漸引起科研工作者的關注。WNK激酶（with no lysine kinase）是一類新發現的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，因其家族成員在激酶功能領域缺乏與ATP結合的賴氨酸而得名[1]。迄今，在人類共發現了該家族的4個成員，即WNK1、WNK2、WNK3和WNK4。其中WNK1有2種類型，全長WNK1（full-length WNK1，L-WNK1）和腎臟特異性WNK1（kidney specific WNK1，KS-WNK1）。許多研究提示，WNK激酶構成了一種新的信號通路，是目前高血壓研究的一個熱點。Maxi K通道，又稱為鈣激活鉀通道，廣泛分布于心肌以外的各種不同組織中如腎臟、神經系統，在平滑肌上分布尤為豐富[2]，與高血壓有著不容忽視的聯系。本研究聚焦于與高血壓關系密切的2個新興分子，WNK1激酶和Maxi K通道，在人胚腎細胞（HEK-293T細胞）上研究WNK1激酶對Maxi K的調節作用，旨在探索高血壓的發病機制，為新的降壓藥的研發提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 HEK-293T細胞株購于上海中科院；WNK1、Maxi K和Vector的質粒DNA均由美國Emory大學醫學院腎臟科蔡暉教授實驗室提供；單克隆小鼠抗HA抗體、單克隆小鼠抗myc抗體、單克隆小鼠抗β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司；FITC標記的山羊抗小鼠IgG、FITC標記的山羊抗兔IgG購于上海鈺森公司；TRITC標記的山羊抗小鼠IgG購于北京中杉公司；實驗設備和實驗場所由溫州醫科大學附屬第二醫院科研中心提供。

1.2 方法

1.2.1 HEK-293T細胞的培養和轉染：HEK-293T細胞常規培養于含10% FBS+1%青/鏈霉素的DMEM培養液的培養皿（規格為10 cm）中，置于細胞培養孵育箱（37 ℃，5% CO2，飽和濕度）內孵育。細胞分離24～36 h觀察到細胞貼壁生長豐度達到70%～80%時，為轉染質粒DNA的最佳時機。將所需的質粒DNA+脂質體2000+OPTI-MEM（不含血清）混合物均勻滴入培養皿中，輕搖混勻，放入細胞培養孵育箱內，5 h后棄去OPTI-MEM（不含血清），加入10 mL細胞培養液，重新放置細胞孵育箱里孵育；細胞轉染質粒DNA后36～48 h，即可進行下一步實驗。

1.2.2 免疫熒光法觀察WNK1激酶對Maxi K在細胞上分布的影響：在1.5 mL的尖底帶蓋離心管中加入0.3 mL OPTI-MEM和3 μL的脂質體2000，混勻；然后在對照組中轉染pCDNA 4.0 Vector（空白質粒）3 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg，實驗組中轉染pCDNA 4.0 his-myc WNK1 3 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg；振蕩混勻后在室溫下放置30 min。再將質粒DNA+脂質體2000+OPTI-MEM混合物均勻滴入培養有HEK-293T細胞的培養皿中，輕搖混勻，放入細胞培養孵育箱（37 ℃，5% CO2，飽和濕度）內，5 h后棄去OPTI-MEM，加入2 mL DMEM細胞培養液，重新放置細胞孵育箱里孵育。細胞轉染后48 h后，進行免疫熒光染色和熒光顯微鏡觀察。實驗中使用單克隆小鼠抗HA抗體和FITC標記山羊抗兔IgG檢測Maxi K，熒光顏色呈現為綠色。細胞轉染所需質粒DNA見表1。

1.2.3 Western blot法觀察WNK1激酶對Maxi K總蛋白表達水平的影響：在HEK-293T細胞上，對照組轉染pCDNA 4.0 Vector 6 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg；實驗組1轉染pCDNA 4.0 his-myc L-WNK1 3 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg；實驗組2轉染pCDNA 4.0 his-myc L-WNK1 6 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg。轉染2 d后，提取蛋白，進行Western blot檢測。實驗中使用的一抗：單克隆小鼠抗myc抗體（1∶500），單克隆小鼠抗β-Actin抗體（1∶500），單克隆兔抗HA抗體（1∶1 000）；二抗：HRP山羊抗小鼠IgG抗體（1∶5 000），HRP山羊抗兔IgG抗體（1∶5 000）。使用Supersignal顯色進行顯影和定影來檢測WNK1、Maxi K和β-actin。細胞轉染所需質粒DNA見表2。

表1 免疫熒光法中細胞轉染所需質粒DNA（n=3）

表2 Western blot法中細胞轉染所需質粒DNA（n=3）

1.3 統計學處理方法 采用SPSS17.0統計學軟件進行數據分析。所有數據均采用±s表示，進行正態性檢驗，多組樣本均數比較進行方差齊性檢驗，方差齊性組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊則采用Dunnett T3檢驗。非正態數據組間采用Krukal-Wallis H檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HEK-293T細胞的形態 HEK-293T細胞株來源于人胚腎上皮細胞，用于本實驗的外源基因的轉染。倒置顯微鏡下觀察HEK-293T細胞貼壁生長，呈三角形或多角形，胞漿透亮，胞核可見，有的胞膜向周圍突起成不規則形，提示細胞生長狀態良好，見圖1。

2.2 免疫熒光結果 對照組轉染pCDNA 4.0 vector（空白質粒）3 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg；實驗組轉染pCDNA 4.0 his-myc L-WNK1 3 μg和pCMVHA Maxi K 1 μg。綠色熒光為Maxi K在細胞上的表達。在對照組中，Maxi K表達量不多，主要位于細胞膜表面，而在實驗組中，Maxi K表達明顯增多，分布于細胞膜和細胞漿內，見圖2。

圖2 HEK-293T細胞免疫熒光結果（×400）

2.3 Western blot結果 與對照組相比，實驗組1和實驗組2 Maxi K總蛋白表達水平均明顯升高（P ＜0.01）。而與實驗組1相比，實驗組2 Maxi K總蛋白表達水平亦明顯升高（P＜0.05）。由此可見，WNK1激酶對Maxi K總蛋白表達存在上調作用，且這種上調作用呈劑量依賴性，見圖3。

圖3 WNK1激酶對Maxi K總蛋白表達水平的影響

3 討論

假性醛固酮減少癥I I型（pseudohypoaldosteronism I I，PHA I I），又稱為Gordon綜合征，臨床上表現為高血壓、高鉀血癥、高氯血癥、代謝性酸中毒和正常的腎小球濾過率。Wilson等[3]發現位于12號染色體上的WNK1基因缺失和位于17號染色體上的WNK4基因錯義突變可導致PHA I I的發生。此后，Hoorn等[4]進一步發現WNK1基因的缺失和WNK4基因的突變導致下游鈉氯共轉運子（sodium chloride cotransporter，NCC）等重吸收鈉氯離子增加所致，拮抗劑噻嗪類利尿藥可有效控制PHA I I患者的高血壓癥狀。目前研究提示，WNK激酶構成了一種新的信號通路，它們是腎臟中多個離子轉運體和通道的上游調控蛋白，在維持腎臟血壓調控及電解質平衡中起非常重要的作用[5-6]。WNK1是WNK家族中第一個被發現的成員，是科研學者在從大鼠腦cDNA文庫中篩選MEK激酶家族新成員時發現。人WNK1基因位于12p13.3，基因全長為150 kb，主要有2個轉錄本，一個為L-WNK1，約12 kb，主要表達在骨骼肌和心臟組織；另一個為短轉錄本，約10 kb，主要表達在腎臟，該轉錄本的產物無蛋白激酶活性，被稱KSWNK1。本研究中的WNK1為L-WNK1。Kahle等[7]研究顯示，WNK1幾個常見的單核苷酸多態性和單倍型與普通人群動態血壓的變化相關。Newhouse等[8]研究發現，一個靠近WNK1啟動子的單核苷酸多態性位點與高血壓的嚴重程度具有相關性，并且提示WNK1表達增加可能提高原發性高血壓的變異性和易感性。

新的研究發現鈣激活鉀通道，又可稱為Maxi K、BK通道或Slo1，為電壓門控鉀離子通道超家族中的一員，電導大（100～300 pS），由Slo1基因編碼。近年來，人們通過研究發現，許多疾病的發生均與Maxi K通道的調節異常有關。生理條件下，Maxi K通道持續激活并作為超極化因素以減少電壓依賴的鈣離子內流，在維持血管平滑肌細胞（smooth muscle cell，SMC）靜息膜電位上起著重要作用。Maxi K被阻斷即可引起平滑肌收縮，進而導致高血壓的產生。在大鼠主動脈及基底動脈SMC和人動脈SMC中，當Maxi K被其特異性抑制劑IbTx阻滯后，它們將產生血管收縮及對抗血管擴張劑的擴血管作用[9]。

目前的研究報道WNK1激酶對血壓及電解質平衡的調控得益于它對多種離子通道和離子轉運體如ROMK、ENaC、NCC及NKCC的調控。至于WNK1對與高血壓密切相關的Maxi K通道是否有調節作用，目前在國內外報道很少。本研究團隊已報道WNK4激酶能抑制Maxi K通道的的表達及分布[10]。所以我們設想，是否WNK1激酶對Maxi K通道亦存在調節作用。基于以上理論及研究思路，本研究在HEK-293T細胞中轉染攜帶WNK1和Maxi K基因的質粒進行研究。通過免疫熒光染色發現WNK1能顯著增加Maxi K在細胞上的分布。而Western blot進一步證實，WNK1能上調Maxi K的總蛋白表達水平，且隨著WNK1 DNA劑量的增加，上調作用逐漸增強，顯示其上調作用具有劑量依賴性。這些結果顯示WNK1激酶和Maxi K通道之間存在一種新的信號途徑。這也解釋了PHA I患者表現高血壓的可能機制，由于患者WNK1基因的缺失導致Maxi K通道表達的減少，不能維持血管SMC的靜息膜電位，從而導致高血壓的產生。和其它膜轉運體或通道的功能可通過其轉運途徑的幾個可能機制被調節一樣，Maxi K通道表達的升高是由于其蛋白合成增加、或減少了蛋白的遷移、降解所致，目前尚不清楚。這也是我們下一步實驗的目標，進一步闡明其可能存在的機制。

我們相信，WNK1激酶對Maxi K通道的調節將是一個新的發現，將對闡明高血壓的發病機制及開發新的降壓藥作用靶點具有重要的意義，有助于設計新的高血壓治療方案，為高血壓患者提供更多更有效的治療藥物。

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[2]NAVARRO-ANTOJIN J, LEVITSKY K L, CALDERON E,

et al.Decreased expression of Maxi-K channel betal-subunit gene repression by hypoxia in cardiacmyocytes role in preconditioning[J].Circ Res, 2009, 104(12): 1364-1372.

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[10]莊捷秋, 王德選, 張益前, 等.WNK4激酶通過溶酶體途徑抑制BK通道表達[J].中華腎臟病雜志, 2012, 28(4): 291-295.

（本文編輯：吳昔昔）

Investigation of the adjusting effect of WNK1 kinase on Maxi K channel

SHI Zhen1, ZHOU Lina2, ZHANG Yiqian1, WANG Dexuan3, ZHUANG Jieqiu3.
1.Department of Nephrology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Nephrology, Wenzhou People’s Hospital, Wenzhou, 325000; 3.Department of Pediatric Nephrology, the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To investigate the adjusting effect of WNK1 kinase on Maxi K channel in HEK-293T cells.Methods: The DNA plasmid carrying WNK1 and Maxi K gene was transfected into the HEK-293T cells, to observe the distribution and total protein expression of Maxi K in the HEK-293T cells via immunofl uorescence microscopy and Western blot.Results: Immunofl uorescence microscopic study showed that Maxi K expression was markedly increased in experimental group compared with the control group.Western blotting analysis showed that total Maxi K protein level was markedly increased in the presence of experimental group 1 and experimental group 2 compared with the control group (P＜0.01).The total Maxi K protein level was markedly increased in experimental group 2 compared with the experimental group 1 (P＜0.05).Conclusion: WNK1 can upregulate total protein expression of Maxi K, and the effect is enhanced with the increasing amount of WNK1 DNA, showing that the effect was dose-dependent.

WNK1; Maxi K; pseudohypoaldosteronism II; hypertension

R544.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.12.003

2016-03-04

國家自然科學基金資助項目（81170709）；溫州市公益性科技計劃項目（Y20150184）。

施珍（1982-），女，浙江麗水人，主治醫師，碩士。

莊捷秋，主任醫師，Email：jieqiuzhuang@hotmail.com。