TNF-α和明膠酶在病毒性心肌炎中的動態(tài)變化

阮妙華，王丹，王凱，周愛華，褚茂平，陳其，錢燕

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 兒科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒童心血管科，浙江 溫州 325027）

?論 著?

TNF-α和明膠酶在病毒性心肌炎中的動態(tài)變化

阮妙華1，王丹1，王凱1，周愛華1，褚茂平2，陳其2，錢燕1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 兒科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒童心血管科，浙江 溫州 325027）

目的：探討TNF-α和明膠酶MMP-2、MMP-9在病毒性心肌炎（VMC）中的動態(tài)變化及其意義。方法：6周齡近交系雄性Balb/c小鼠隨機(jī)分為對照組（n=35）和感染組（n=60），分別給予PBS和含10-5.69TCID50/mL 的CVB3液0.1 mL注射，分別在第4、第10、第21、第30天各隨機(jī)取8只小鼠處死并取血和心臟標(biāo)本。Reed-Muench法測定接種病毒滴度；HE染色后光鏡觀察心肌組織病理學(xué)改變；免疫組織化學(xué)法、Western blot和實(shí)時熒光定量PCR法分別檢測心肌組織MMP-2、MMP-9蛋白及其mRNA的表達(dá)；ELISA法檢測血清TNF-α的濃度變化。結(jié)果：與對照組比較，感染組血清TNF-α濃度明顯升高（P＜0.05），心肌組織MMP-2和MMP-9蛋白及其mRNA表達(dá)均顯著增高（P＜0.05）。MMP-2、MMP-9表達(dá)與心肌病理積分、TNF-α濃度均呈正相關(guān)。結(jié)論：在小鼠CVB3心肌炎中TNF-α及其下游產(chǎn)物MMP-2和MMP-9水平上調(diào)，可能參與VMC的病理生理過程。

腫瘤壞死因子；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；病毒性心肌炎；小鼠

在兒童和成人急性心肌炎中，柯薩奇B組3型病毒（CVB3）感染最為常見，10%～20%的患者可進(jìn)展至慢性心肌炎和擴(kuò)張性心肌病。但是心肌炎由急性進(jìn)展至慢性的發(fā)病機(jī)制，目前仍不明確[1]。近年來研究[2]表明，病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）中炎性細(xì)胞浸潤和壞死程度與炎癥因子TNF-α的水平正相關(guān)。同時，各種不同細(xì)胞模型研究[3-5]

證實(shí)，TNF-α可通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的表達(dá)和活性參與心肌炎的病理生理過程。而MMPs成員中MMP-2和MMP-9對細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用最廣泛[6]。目前在國內(nèi)外CVB3小鼠心肌炎模型中，關(guān)于急性進(jìn)展至慢性的研究甚少。因此，本研究通過觀察VMC心肌組織中TNF-α以及MMP-2、MMP-9的動態(tài)變化，初步探討其在VMC病理生理變化過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒：CVB3購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.1.2 動物：Balb/c小鼠95只，4～6周齡，近交系雄性，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2003-0003。隨機(jī)分為對照組（n= 35）和感染組（n=60）。

1.1.3 試劑：兔源MMP-2多克隆抗體、HE染色試劑盒、TNF-α ELISA檢測試劑盒、即用型SABC過氧化物酶等均購自武漢博士德公司，羊源MMP-9多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，小鼠MMP-2、MMP-9、GAPDH引物及探針序列由廣州達(dá)輝生物技術(shù)有限公司合成，總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增所需的酶及其他試劑購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立：感染動物模型按照Wang 等[7]的方法建立。感染組小鼠經(jīng)腹腔接種含10-5.69TCID50/mL的CVB3液0.1 mL，對照組注射相同劑量PBS。

1.2.2 標(biāo)本的采集：分別于接種后的第4、第10、第21、第30天各隨機(jī)取8只小鼠處死并取血測TNF-α的濃度；取心臟標(biāo)本做病理組織學(xué)檢查。

1.2.3 光學(xué)顯微鏡檢查：心肌組織用10%甲醛固定、脫水、包埋、切片，HE染色后病理學(xué)檢查。采用半定量方法計(jì)算心肌病理組織學(xué)積分，即每張切片隨機(jī)取5個高倍視野，計(jì)算每個視野中炎性細(xì)胞浸潤及壞死區(qū)域面積與整個視野面積之比，無病變計(jì)0分，病變面積＜25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，50%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。

1.2.4 血清TNF-α水平的檢測：應(yīng)用雙抗體夾心ELISA法，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.5 心肌組織MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)檢測：應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC法，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.6 實(shí)時熒光定量PCR檢測：按Trizol方法提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在20 μL的反應(yīng)體系中分別加入樣本RNA 2 μg，RT butter（5×）5 μL，10 mmol dNTPs 1 μL，N9隨機(jī)引物1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶MMLV 1 μL，RNA酶抑制劑1 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，加DEPC處理水到20 μL，混勻后于下列溫度反應(yīng)：37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，滅活MMLV，產(chǎn)物即為cDNA。PCR擴(kuò)增：在50 μL反應(yīng)體系中加入cDNA 5 μL，ddH2O 32 μL，PCR buffer（5×）10 μL，熒光探針0.5 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，dNTPs 0.5 μL，擴(kuò)增條件參照說明書。數(shù)據(jù)通過儀器自帶的軟件ABI Prism 7300 SDS Software進(jìn)行分析，以MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA與GAPDH的相對表達(dá)量代表MMP-2 mRNA 和MMP-9 mRNA表達(dá)水平。

1.2.7 Western blot檢測：按試劑盒說明提取蛋白質(zhì)。99 ℃煮沸蛋白質(zhì)樣品10 min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜，室溫下膜浸入5%脫脂牛奶30 min，I抗MMP-2（1∶1 000稀釋）抗體、MMP-9（1∶500稀釋）抗體4 ℃過夜。TBST清洗NC膜，每次10 min，共3次。然后，NC膜浸泡于相對應(yīng)的I I抗（1∶2 000稀釋），室溫孵育1～2 h，清洗后顯色。用Image J圖像分析軟件對印跡條帶進(jìn)行定量分析，分別計(jì)算MMP-2、MMP-9與actin光密度的比值得到其相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，均以±s表示，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。兩指標(biāo)表達(dá)相關(guān)性采用pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

感染組小鼠在接種病毒后出現(xiàn)體質(zhì)量下降、活動減少，第5天開始出現(xiàn)死亡，第10天達(dá)死亡高峰，共死亡9只；對照組小鼠體質(zhì)量增加，活動良好，無死亡。

2.1 心肌病理組織學(xué)改變 HE染色顯示：感染組小鼠感染第4天開始出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤；第10天心肌細(xì)胞開始出現(xiàn)混濁腫脹和溶解壞死，炎性細(xì)胞呈灶狀浸潤，心肌腫脹壞死；第21天部分炎性細(xì)胞開始吸收，心肌纖維排列紊亂；第30天炎性細(xì)胞基本消失，心肌間質(zhì)和血管周圍心肌纖維化明顯。正常組小鼠心肌結(jié)構(gòu)完整，未見炎性細(xì)胞浸潤。感染組各時間點(diǎn)病理積分（正常組各時間點(diǎn)病理積分均為0）見圖1。

圖1 感染組小鼠心肌不同時間點(diǎn)病理積分比較

2.2 2組血清TNF-α濃度 感染組小鼠在感染后第4天血清TNF-α濃度為（25.91±0.55）pg/mL，與對照組的（16.16±0.17）pg/mL比較明顯升高，感染組第10天血清TNF-α濃度進(jìn)一步升高，達(dá)（31.02± 0.78）pg/mL，此后，濃度呈下降趨勢，但仍高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 2組血清TNF-α濃度比較

2.3 心肌組織MMP-2、MMP-9蛋白以及mRNA的表達(dá)變化 對照組小鼠中，心肌組織中MMP-9蛋白不表達(dá)，MMP-2蛋白以及mRNA弱表達(dá)。感染組第4天開始表達(dá)增加，第10天達(dá)高峰，此后表達(dá)呈下降趨勢，但與對照組比較，仍顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3-5。

2.4 相關(guān)性分析 直線相關(guān)性分析顯示MMP-2、MMP-9與心肌病理積分、TNF-α均呈正相關(guān)，見表1。

圖3 小鼠各時間點(diǎn)心肌組織MMP-2（A）和MMP-9（B）陽性表達(dá)面積（%）比較

圖4 小鼠各時間點(diǎn)心肌組織MMP-2（A）和MMP-9（B）mRNA表達(dá)比較

圖5 小鼠各時間點(diǎn)心肌組織MMP-2（A）和MMP-9（B）蛋白表達(dá)比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)觀察到感染組MMP-9主要在炎性細(xì)胞以及壞死的心肌細(xì)胞中表達(dá)，對照組心肌呈陰性表達(dá)；而MMP-2在正常對照組血管內(nèi)皮細(xì)胞弱陽性表達(dá)，感染組在局灶壞死部位及周圍心肌細(xì)胞上陽性表達(dá)。同時，本實(shí)驗(yàn)用Western blot方法，證實(shí)MMP-2 和MMP-9的表達(dá)與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致，均呈一過性增高，于感染第4天即開始增加，第10天達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，30 d時仍未降到正常水平，RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA水平也呈同步變化。

表1 各指標(biāo)相關(guān)性分析（r）

MMPs是一組能特異性降細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分的鋅鈣依賴性蛋白水解酶家族，其正常表達(dá)對維持心肌間質(zhì)膠原合成與降解代謝的動態(tài)平衡有重要的作用。MMPs通過作用于ECM，介導(dǎo)炎性細(xì)胞的浸潤[8-13]，參與了心血管疾病的發(fā)病機(jī)制，成為心室改建、泵功能減退的直接原因之一。明膠酶包括MMP-2和MMP-9，是目前研究的熱點(diǎn)[14-17]。而TNF-α是一種重要的炎性介質(zhì)，通過參與免疫病理反應(yīng)，從而參與VMC的病理生理過程。近年來在心臟離體組織體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞都可分泌TNF-α[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，心肌炎急性期TNF-α濃度升高時，MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)和mRNA水平也進(jìn)行性升高；恢復(fù)期，TNF-α濃度下降時，MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)和mRNA水平也呈下降趨勢。相關(guān)分析顯示，MMPs的蛋白表達(dá)與病理積分、TNF-α濃度呈正相關(guān)，這與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的TNF-α是MMPs的激活劑相符，提示MMPs表達(dá)增加是VMC炎癥作用的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α主要通過作用于MMP-2和MMP-9的啟動子基因，誘導(dǎo)MMP-2和MMP-9的活性增強(qiáng)、表達(dá)增加[19]；抑制TNF-α的活性，可顯著下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)[1-3]，進(jìn)一步證實(shí)TNF-α/MMP-2、9的上下通路關(guān)系。

Lin等[20]和Alexey等[21]報(bào)道，在A549細(xì)胞中，TNF-α主要通過促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和NF-κB 3條途徑上調(diào)MMP-9的表達(dá)。TNF-α/MMPs通路是否通過上述路徑參與心肌炎的病理生理機(jī)制是本課題組接下來的研究重點(diǎn)。

[1]WEHBE M, HUGUENIN A, LEVEQUE N, et al.Construction of a subgenomic CVB3 replicon expressing emerald green fl uorescent protein to assess viral replication of a cardiotropic enterovirus strain in cultured human cells[J].J Virol Methods, 2016, 230: 1-8.

[2]ARSEN D, PANKUWEIT S, MAKSIMOVIC R, et al.Pericardial cytokines in neoplastic, autoreactive, and viral pericarditis[J].Heart Failure Rev, 2013, 18(3): 345-353.

[3]QIAN C, YAN J, JIN S, et al.Artemisinin inhibits the proliferation, migration, and infl ammatory reaction induced by tumor necrosis factor-α in vascular smooth muscle cells through nuclear factor kappa B pathway[J].J Surg Res, 2015, 194(2): 667-678.

[4]JEONG J W, KIM J W, KU S K, et al.Essential oils purifi ed from Schisandrae semen inhibits tumor necrosis factor-αinduced matrix metalloproteinase-9 activation and migration of human aortic smooth muscle cells[J].BMC Complementary Altern Med, 2015, 15(1): 1-13.

[5]ZHU X, WANG Z, HU C, et al.Honokiol suppresses TNF-α-induced migration and matrix metalloproteinase expression by blocking NF-κB activation via the ERK signaling pathway in rat aortic smooth muscle cells[J].Acta Histochem, 2014, 116(4): 588-595.

[6]YUAN L, XU B, NA W, et al.Association of MMPs and TIMPs with the occurrence of atrial fi brillation: a systematic review and meta-analysis[J].Can J Cardiol, 2015, 32(6): 803-813.

[7]WANG H, QI C, FANGQI G, et al.Cardioprotection of H2S by downregulating iNOS and upregulating HO-1 expression in mice with CVB3-induced myocarditis[J].Life Sci, 2013, 93(24): 949-954.

[8]LINDSEY M L, IYER R P, JUNG M, et al.Matrix metalloproteinases as input and output signals for post-myocardial infarctio[J].J Mol Cell Cardiol, 2015, 91: 134-140.

[9]GARMAROUDI F S, MARCHANT D, HENDRY R, et al.Coxsackievirus B3 replication and pathogenesis[J].Future Microbiol, 2015, 10: 629-653.

[10]HENDRY R G, BILAWCHUK L M, MARCHANT D J.Targeting matrix metalloproteinase activity and expression for the treatment of viral myocarditis[J].J Cardiovasc Transl Res, 2014, 7(2): 212-225.

[11]LI Y C, GE L S, GUAN X Q, et al.The mechanism of carvedilol in experimental viral myocarditis[J].Curr Pharm Des, 2012, 18(12): 1620-1624.

[12]WESTERNMANN D, SAVVATIS K S, CHULTHEISS H P, Tschope C.Immunomodulation and matrix metalloproteinases in viral myocarditis[J].J Mol Cell Cardiol, 2010, 48(3): 468-473.

[13]章惺惺, 鄭佳音, 吳文俊, 等.1型糖尿病早期腎病患者血清MMP-9、MMP-2水平的檢測及其臨床意義[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 40(3): 259-261.

[14]SOLOVYEVA N I, TIMOSHENKO O S, GUREEVA T A, et al.Matrix metalloproteinases and their endogenous regulators in squamous cervical carcinoma[J].Biomed Khim, 2015, 61(6): 694-704.

[15]YI Y, ROSENBERG G A.Matrix metalloproteinases as therapeutic targets for stroke[J].Brain Res, 2015, 1623: 30-38.

[16]YUAN L, XU B, NA W, et al.Association of MMPs and TIMPs with the occurrence of atrial fi brillation: a systematic review and meta-analysis[J].Can J Cardiol, 2016, 32(6): 803-813.

[17]DOREN S R V.Matrix metalloproteinase interactions with collagen and elastin[J].Matrix Biol, 2015, 44-46: 224-231.

[18]XUE H, SUN K, XIE W, et al.Etanercept attenuates shortterm cigarette-smoke-exposure-induced pulmonary arterial remodelling in rats by suppressing the activation of TNF-a/ NF-kB signal and the activities of MMP-2 and MMP-9[J].Pulm Pharmacol Ther, 2012, 25(3): 208-215.

[19]MANICONE A M, MCGUIRE J K.Matrix metalloproteinases as modulators of infl ammation[J].Semin Cell Dev Biol, 2008, 19(1): 34-41.

[20]LIN C C, TSENG H W, HSIEH H L, et al.Tumor necrosis factor-α induces MMP-9 expression via p42/p44 MAPK, JNK, and nuclear factor-κB in A549 cells[J].Toxicol Appl Pharmacol, 2008, 229(3): 386-398.

[21]AlEXEY E, PAVITHRA S, RAMA S, et al.IL-6, IL-8, MMP-2, MMP-9 are overexpressed in Fanconi anemia cells through a NF-κB/TNF-α dependent mechanism[J].Mol Carcinog, 2014, 54(12): 1686-1699.

（本文編輯：丁敏嬌）

Dynamic changes of TNF-α and gelatinase on murine viral myocarditis model

RUAN Miaohua1, WANG Dan1, WANG Kai1, ZHOU Aihua1, CHU Maoping2, CHEN Qi2, QIAN Yan1.
1.Department of Pediatrics, the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Pediatric Cardiovascular disease, the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To explore the dynarnic changes and its meaning of TNF-α and gelatinase on the murine viral myocarditis model.Methods: Six-week-old inbred male mice were randomly assigned to control (n=35) and myocarditis group (n=60).The myocarditis and the control groups were inoculated intraperitoneally with 0.1 mL 10-5.69TCID50/mL CVB3 or vehicle (PBS) alone respectively.Eight mice were sacrifi ced at 4th day, 10th day, 21th day and 30th day after injection.The serum content of TNF-α was measured by ELISA.The myocardial levels of MMP-2 and MMP-9 were determined by Western blot, MMP-2 mRNA and MMP-9 mRNA were measured by RT-PCR.Results: Compared with the control group, the protein and mRNA expression of MMP-2 and MMP-9 in the myocardium and the serum contents of TNF-α were significantly increased in myocarditis group (P＜0.05).Conclusion: The expression of TNF-α and its downstream production MMP-2 and MMP-9 are increased in mice with acute viral myocarditis, and it may be involved in the pathogenesis of viral myocarditis.

tumor necrosis factor; matrix metalloproteinases-2; matrix metalloproteinases-9; myocarditis; mice

R3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.12.009

2016-04-18

溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20150142）。

阮妙華（1984-），女，浙江溫州人，住院醫(yī)師，碩士。

陳其，主任醫(yī)師，Email：cqq57@126.com。