大鼠脊髓損傷后形態學觀察和LIMK1表達的研究

李廣賢 王日光 姜洪豐 劉金榜 牛云峰

大鼠脊髓損傷后形態學觀察和LIMK1表達的研究

李廣賢 王日光 姜洪豐 劉金榜 牛云峰

目的通過監測大鼠脊髓損傷后其形態學和LIMK1、GFAP蛋白表達水平的動態改變，對脊髓損傷后LIMKL1是否參與膠質瘢痕的形成及調控進行初步研究。方法Wistar成年大鼠54只，隨機分為3組：對照組、假傷組和SCI組，SCI組采用改良Allen's致傷裝置制作大鼠脊髓損傷模型，采用BBB運動功能評分法觀察大鼠后肢功能恢復情況。分別于術后1、2、3、4周取材，通過HE染色、免疫組化、免疫熒光等方法，觀察傷后不同時期脊髓的病理變化及LIMK1、GFAP的表達情況。結果SCI組死亡率33%，BBB評分示SCI組術后2周后肢運動功能有明顯恢復（P＜0.01）。LIMK1、GFAP的免疫組化和激光共聚焦顯微鏡分析結果基本一致，兩者蛋白水平表達均于傷后1周增高。GFAP表達于3周達峰值，4周時開始下降；LIMK1在傷后1周時出現峰值，2周開始波動下降，3周時達峰值，4周開始下降。結論大鼠脊髓損傷后，LIMK1和GFAP表達密切相關，結合LIMK1蛋白表達譜，提示LIMK1通路參與膠質瘢痕的形成和調控。

脊髓損傷LIM結構域激酶1膠質纖維酸性蛋白

脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）的修復一直是臨床研究的熱點和難點[1]。本研究試圖尋求一種在分子水平可以調控膠質瘢痕，并促進神經再生的作用靶點，為最大可能控制及恢復脊髓神經細胞的功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

成年健康Wistar大鼠54只，體質量200～220 g（佳木斯大學實驗動物中心），隨機分成對照組、假傷組和SCI組（按損傷時間分1、2、3、4周4個亞組）。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗大鼠單絲氨酸蛋白激酶1（LIMK1）多克隆抗體、兔抗大鼠膠質纖維酸性蛋白（GFAP）多克隆抗體、FITC標記的熒光二抗（北京博奧森生物技術有限公司）；即用型SP-9001 HistostainTM-Plus Kits免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

ECLIPSE E100光學顯微鏡（日本NIKON公司）；LS-3050A全自動生物組織脫水機（沈陽市龍首電子儀器有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 大鼠脊髓損傷模型制備

大鼠常規飼養，觀察健康狀況及四肢活動無異常7 d后開始手術。對照組：不作特殊處理；假傷組：用10%水合氯醛（40 mg/Kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定，背部剃毛，常規消毒鋪巾，以T10棘突為中心作長約2～3 cm的后正中切口，逐層切開皮膚及皮下組織，剝離椎旁肌肉并暴露棘突與椎板，咬除T9到T11的棘突與椎板，骨窗大小約為4 mm×8 mm，不損傷硬膜及脊髓；SCI組：在上述操作基礎上，模仿Allen's法[2]，用重10 g、直徑4 mm的重錘自7 cm處沿瞄準器垂直落下，通過半徑3 mm的圓形墊片（與脊髓直徑大小相吻合）造成該段脊髓后正中部的沖擊傷，止血，局部使用適量青霉素，逐層關閉傷口。術后8 h內使用保溫器維持模型大鼠體溫于37℃左右（可最大限度避免術后低體溫死亡）。每只大鼠術畢每日肌注青霉素鈉5萬U，觀察皮膚有無壓瘡或感染、下肢有無潰爛，必要時繼續注射青霉素。術后每天兩次定時人工膀胱排尿，直至建立反射性膀胱排空（約在術后1周）。

1.4 大鼠SCI組傷后神經功能評估

采用BBB（Basso,Beattie,and Bresnahan Locomotor Rating Scale）運動功能評分法[3]。0分：無可見的自發活動；0～7分：后肢有不同程度的關節活動；8～12分：后肢無負重或部分負重著地；13～16分：動物持續負重并能行走；17～20分：接近正常的活動，但遺留輕度功能缺陷；21分：運動功能正常。

1.5 取材及標本制作

分別于傷后1、2、3、4周取材。腹腔麻醉后，以損傷區為中心切開創口，從其頭尾兩端向致傷處咬開椎板，仔細剝離黏連組織，取出脊髓（長約1.5 cm），包含損傷區及上下段脊髓，置于中性甲醛中固定48 h。充分漂洗過夜，標本在全自動生物組織脫水機內脫水48 h，脫水、石蠟包埋后切片（以距離脊髓直接損傷邊緣處約1 mm部位開始切片，厚度5 μm），分別行HE染色、Nissl染色、SP免疫組化染色及免疫熒光檢測。HE染色后光鏡下觀察脊髓組織損傷情況；Nissl染色后光鏡下觀察脊髓損傷后神經元細胞、尼氏小體的改變；SP免疫組化染色動態檢測LIMK1及GFAP表達情況；選取損傷中心切片，進一步行免疫熒光染色，采用激光共聚焦顯微鏡（孔徑130 nm）對LIMK1及GFAP的表達進行定量分析，每張切片隨機取6個完整而不重疊的高倍視野，用激光共聚焦顯微鏡自帶系統（Olmpus-FV1000）測量每個視野下的光密度，取6個視野的平均光密度值。

1.6 圖像數據處理和統計學分析

SP免疫組化染色后，每個時間點平均取3張切片，每張切片隨機選取4個視野（100倍），計算每組平均陽性細胞數；通過激光共聚焦顯微鏡計算機自動分析系統，計量LIMK1和GFAP相對熒光密度值。應用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析，數據采用(x±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結果

2.1 脊髓損傷大鼠一般情況和運動功能評價

SCI組大鼠死亡率為33%，原因可能是低體溫、腹脹、下肢褥瘡、自食肢體合并感染、呼吸或泌尿系統感染。正常組和假手術組未發現明顯特殊變化，亦未見死亡情況出現。

術后3 d時剔除5只對BBB評分偏離較大的模型大鼠。對照組和假傷組大鼠三項評分均為21分，SCI組傷后1 d大鼠的后肢BBB評分均為0分，傷后1周功能恢復較快，傷后2周功能恢復顯著，后期功能恢復較前兩周明顯減弱，呈緩慢恢復狀態。SCI組2周和3周、3周和4周之間的BBB評分差異無統計學意義，但2周和4周之間有差異明顯（P＜0.05）（表1）。

表1 各組BBB評分結果（n=6）Table 1BBB score in each group(n=6)

2.2 SCI后組織病理學變化特點

HE染色觀察發現，對照組和假傷組脊髓組織細胞形態完整，神經元數量較多，排列整齊，神經纖維結構正常；SCI組傷后l周，髓內可見散在的尚未完全吸收的出血、水腫，損傷區神經細胞壞死，神經元數目減少；SCI組2周時，以損傷區為中心，神經元數目明顯減少，囊腔形成，周圍有炎細胞浸潤，但與周圍尚不完全清楚；SCI組3、4周時，神經細胞明顯減少，部分神經元結構不清，變性壞死，囊腔周圍可見有致密的膠質癱痕增生（圖1）。

圖1 脊髓組織HE染色Fig.1HE staining of spinal cord tissue

尼氏染色觀察發現，對照組和假傷組Nissl染色神經元胞體內尼氏小體豐富，無空泡，核膜完整。SCI組術后2周、4周時，可見神經元數目減少、邊界模糊，尼氏小體減少，核周有深紫色團塊狀染色質，核膜破裂，胞漿嗜酸性改變并可見核膜完整的凋亡細胞及壞死細胞（圖2）。

圖2 脊髓組織Nissl染色Fig.2Nissl staining of spinal cord tissue

2.3 LIMK1、GFAP免疫組織化學染色觀察

正常LIMK1主要表達在細胞質中，SCI組1周時，陽性細胞表達明顯增強，達峰值；傷后2周表達下降，陽性細胞明顯減少，且低于正常值；3、4周時又開始升高，并且在傷后3周時形成一個峰值（表2）。

表2 免疫組化染色觀察各組LIMK1和GFAP表達（n=6）Table 2The expression of LIMK1 and GFAP in each group by immunohistochemical staining(n=6)

SCI組1周時，GFAP表達略有增強，其邊緣膠質細胞胞體稍有肥大；傷后2周，損傷處GFAP在星形膠質細胞胞體和突起的表達增強，數量增多，囊腔開始形成，邊界不清；3、4周時，損傷區囊腔邊界清晰，周圍形成膠質瘢痕，瘢痕內星形膠質細胞胞體肥大，突起增多、增粗、變長，細胞排列緊密且陽性細胞數明顯增多，以靠近囊腔處最為密集（圖3、4）。

圖3 LIMK1免疫組織化學染色觀察Fig.3Immunohistochemical staining of LIMK1

圖4 GFAP免疫組織化學染色觀察Fig.4Immunohistochemical staining of GFAP

2.4 激光共聚焦顯微鏡

免疫熒光標記后，激光共聚焦顯微鏡觀察發現，SCI組1周時，LIMK1熒光強度明顯高于正常及假傷組，2周后下降，3周后再次上升并達峰值，4周時略有下降，但仍高于正常（表3）。GFAP免疫熒光標記顯示，SCI組1周時熒光密度略有增強，于3周后達峰值，形態變化同IHC所述（圖5、6）。

表3 免疫熒光觀察各組LIMK1和GFAP表達（n=6）Table 3The expression of LIMK1 and GFAP in each groupby immunofluorescence assay(n=6)

圖5 LIMK1免疫熒光觀察（100×）Fig.5Immunofluorescence assay of LIMK1(100×)

圖6 GFAP免疫熒光觀察（100×）Fig.6Immunofluorescence assay of GFAP(100×)

3 討論

GFAP構成星形膠質細胞的主要細胞骨架，其表達的高低可反應星形膠質細胞的功能狀態與膠質化程度[4]。脊髓創傷性損傷后，星形膠質細胞發生明顯的迅速反應，形成反應性膠質化增生或膠質瘢痕。本實驗觀察到在大鼠SCI組損傷1周時，細胞胞體肥大，突起增粗延長，即典型的反應性膠質化特征。

研究表明，SCI組損傷后星形膠質細胞的反應性膠質化具有雙重作用，即幼稚期的誘導作用和成熟期的阻抑作用[5]。我們觀察到大鼠脊髓損傷后2周，在損傷區形成囊腔，4周后在囊腔周圍可見有胞體肥大增生的突起，并相互交織形成致密的膠質瘢痕，而此時囊腔內未見GFAP的表達，可見膠質瘢痕在損傷區對于神經軸突再生具有機械性阻抑作用。

此外，研究證實膠質瘢痕還能分泌多種神經生長抑制分子，后者在損傷區抑制軸突的生長，在神經軸突再生過程中形成另一不可逾越的化學屏障[6]。

在損傷區膠質瘢痕中分泌的抑制分子包括MAG、Tenascin-R、CSPGs[7]和多種蛋白多糖。體內與體外實驗充分證明，上述抑制分子中的髓磷脂相關抑制分子（CSPGs等）主要是通過Rho-ROCKⅡ信號途徑傳遞抑制信號，即均與受體Nogo-66receptor、NgR特異性結合后，形成P75NTR/NgR、P75NT/NgR/ Lingo-1復合物，傳遞胞外抑制信號至質膜內，作用于細胞內小鳥苷三磷酸酶（GTP酶）-Rho，依次激活下游底物，產生級聯瀑布信號傳遞，使生長錐內的肌球蛋白和肌動蛋白絲收縮，抑制actin結合蛋白的解聚能力，影響微管的動態平衡，使神經軸突生長錐始終處以被抑制狀態，生長錐塌陷[8]。

LIMK1是ROCK下游底物，主要定位于胞漿內。LIMK能夠被ROCK以及PAK4磷酸化而激活，LIMK1激活后磷酸化Cofilin使之失活，繼而抑制纖絲狀actin的解聚，參與actin細胞骨架的重組[9]。Arber等[10]報道，活化的小分子GTP酶Rac（RacV12）和LIMK-1產生協同效應，能促進LIMK-1和Cofilin的磷酸化，使得共轉染的細胞中纖絲狀肌動蛋白纖維變粗。Nakayama等[11]通過體外實驗證實，細胞骨架與其收縮有關，細胞骨架中微絲的主要結構成份是actin，與肌球蛋白、細胞內游離Ca2+及相關蛋白形成一個成纖維細胞內收縮系統，當病理性因素持久存在時，促進actin的聚合，使收縮系統發生強烈而持久的收縮，最終導致膠質瘢痕和瘢痕攣縮的發生。

我們通過免疫組化染色和免疫熒光的方法，動態觀察LIMK1和GFAP蛋白表達的變化，發現LIMK1在脊髓損傷后1周，蛋白表達明顯升高；2周時蛋白表達下降；但是到傷后3周又出現一峰值，相對熒光密度和陽性細胞數分別為（3547.16±484.26）和（29.91±9.92）；4周時蛋白表達開始下降。GFAP從傷后1周，其表達就開始逐漸升高，在3周時達峰值。我們發現，LIMK1和GFAP在脊髓損傷后3周均達峰值，提示LIMK1與膠質瘢痕的形成存在相關性，即LIMK1可能參與膠質瘢痕的形成。

但是實驗發現，LIMK1在傷后2周時表達明顯下降，甚至低于正常值。我們推測，可能與該時間段SSH負反饋于LIMK1，去磷酸化恢復Cofilin解聚肌動蛋白的活性有關[12]。

綜上所述，脊髓損傷后膠質瘢痕成為神經再生的機械和化學屏障，肌動蛋白細胞骨架的動力機制在瘢痕形成中的作用已得到肯定，因而LIMK-1作為肌動蛋白細胞骨架的調控子，在瘢痕防治中的意義值得探討，這將為脊髓損傷后抑制膠質瘢痕，促進神經再生的分子治療，提供一個潛在的作用靶點。

4 存在的問題和展望

目前，對脊髓損傷的研究多集中在如何促進神經細胞及軸突再生方面，而對膠質瘢痕形成及其調控方面的研究甚少。本實驗發現LIMK1通路參與膠質瘢痕的形成，可作為調控膠質瘢痕的一個作用靶點，但是，脊髓損傷后LIMK1和Slingshot在信號傳導網絡中是如何相互制約的？LIMK1的活性表達是如何在時間和空間上被精準控制的？這些都是本研究領域中需要進一步解決的問題。

對脊髓損傷后調控膠質瘢痕，促進軸突再生的研究，尚期待新的突破，全面而系統地對LIMK1通路中各因子變化進行研究，將為有效抑制膠質瘢痕形成并徹底治療脊髓損傷指明方向。

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Research on Histological Changes and Expression of LIMK1 after Spinal Cord Injury in Rats

LI Guangxian1,WANG Riguang2,JIANG Hongfeng3,LIU Jinbang1,NIU Yunfeng1．1 Anyang Area Hospital,Anyang 455000,China;2 First Hospital Affiliated to Jiamusi University,Jiamusi 154000,China;3 Tianjin Hospital,Tianjin 300000,China.

ObjectiveTo observe the expression of LIMK1,GFAP and the histological changes after SCI,and to explore whether LIMK1 participate in the formation and control of pathological glial scar.MethodsFifty-four adult Wistar rats were randomly divided into 3 groups:one group was made as control group,one group only accepted the pseudo-operation, the others were made as spinal cord injury(SCI)model by the modified Allen's impact device.Locomotor capacity was assessed according to the 21-point Basso,Beanie and Bresnahan score;The lesions were observed with light microscopy and confocal laser scanning microscope at 1,2,3 and 4 weeks after SCI.The LIMK1 and GFAP were also observed by immunohistochemistry(IHC)and immunofluorescence assay.ResultsThe mortality rate of SCI group was 33%.BBB scale of hind limb movements showed significant recovery of motor function after SCI in rats(P＜0.01).There is a high degree of concordance between IHC and laser scanning confocal analysis for LIMK1 and GFAP.Both of the protein expression level increased at 1 week after SCI.The expression of GFAP reached the peak at 3 weeks after injury,and began to fail at 4 weeks.The peak of LIMK1 showed immediately at 1 week,then dropped at 2 weeks.But another peak was formed at 3 weeks and began to fail at 4 weeks.ConclusionAfter spinal cord injury,the expression of LIMK1 and GFAP are closely related.The expression profile of LIMK1 suggests that LIMK1 may play an important role in the glial scar development.

Spinal cord injury;LIM domain kinase 1;Glial fibrillry acidic protein

R744

A

1673－0364（2016）06－0353－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.006

2016年8月13日；

2016年10月21日）

455000河南省安陽市河南省安陽地區醫院（李廣賢，劉金榜，牛云峰）；154000黑龍江省佳木斯市佳木斯大學第一附屬醫院（王日光）；300000天津市天津醫院（姜洪豐）。