嬰兒配方粉中克羅諾桿菌屬菌株的分子溯源技術(shù)

陳萬(wàn)義，劉振民，任 婧

（光明乳業(yè)股份有限公司光明乳業(yè)研究院，乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200436）

嬰兒配方粉中克羅諾桿菌屬菌株的分子溯源技術(shù)

陳萬(wàn)義，劉振民，任 婧

（光明乳業(yè)股份有限公司光明乳業(yè)研究院，乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200436）

克羅諾桿菌屬菌株水平上的快速準(zhǔn)確的鑒定和區(qū)分對(duì)于控制由該屬引起的食源性疾病的監(jiān)控、預(yù)防和控制具有十分重要的意義。同時(shí)，對(duì)于分子流行病學(xué)的研究也是至關(guān)重要的。越來(lái)越多的基因分型方法已經(jīng)被用于克羅諾桿菌屬內(nèi)菌株的分子分型。為了切斷克羅諾桿菌屬菌株的傳播途徑和快速確定感染源，本綜述主要針對(duì)目前克羅諾桿菌屬菌株的分子分型方法進(jìn)行了較為詳細(xì)的探討。簡(jiǎn)要介紹了克羅諾桿菌屬分子分型方法的最新研究進(jìn)展，以便發(fā)生乳粉污染克羅諾桿菌屬菌株時(shí)能夠快速溯源，防止食物中毒事件的進(jìn)一步蔓延。

克羅諾桿菌屬；鑒定；分子分型

0 引言

克羅諾桿菌屬（原阪崎腸桿菌）是人和動(dòng)物腸道內(nèi)寄生的一種革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌。直至1980年，其被鑒定命名為阪崎腸桿菌（Enterbacter sakazakii），歸屬于腸桿菌科腸桿菌屬，并包括15個(gè)生物型［1］。2012年，Joseph等［2-4］根據(jù)多序列比對(duì)分析（Multilocus Sequence Typing）將克羅諾桿菌屬分成7個(gè)種，分別是阪崎克羅諾桿菌（C.sakazakii），丙二酸鹽克羅諾桿菌（C.malonaticus），蘇黎世克羅諾桿菌（C.turicensis），穆汀斯克羅諾桿菌（C.muytjensii），都柏林克羅諾桿菌（C.dublinensis），尤尼沃斯克羅諾桿（C.universalis），康帝蒙提克羅諾桿菌（C.condimenti）［5-7］。

克羅諾桿菌屬內(nèi)7個(gè)種對(duì)化學(xué)物質(zhì)的敏感性以及溫度和抗生素方面存在較大的差異［8-10］，從而導(dǎo)致的致病力大小也不盡相同［11-13］。因此，采用分子溯源方法能夠正確鑒定和快速區(qū)別不同來(lái)源的克羅諾桿菌屬菌株。

1 分子溯源方法

1.1 血清學(xué)分型

存在于革蘭氏陰性細(xì)菌外膜中的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的一部分為其O抗原的組成成分，而且是細(xì)胞壁中最易產(chǎn)生變化的組分之一［14］。革蘭氏陰性細(xì)菌該部位物質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化構(gòu)成了血清學(xué)分型的理論基礎(chǔ)。由于阪崎克羅諾桿菌特異的血清型和嬰兒腸炎的發(fā)生有著直接的相關(guān)性，因此鑒定阪崎克羅諾桿菌的血清型對(duì)于流行病學(xué)調(diào)查一直被廣泛應(yīng)用。2008年Mullane et al根據(jù)基因weh設(shè)計(jì)引物去鑒定阪崎克羅諾桿菌的抗原O1和O2［15］。2012年，在前人的研究基礎(chǔ)上，南開大學(xué)的王磊教授系統(tǒng)研究了阪崎克羅諾桿菌的0抗原基因簇［16］，完善了阪崎克羅諾桿菌7種O抗原的PCR鑒定方法。

1.2 脈沖場(chǎng)凝膠電泳

脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一種非擴(kuò)增的基于對(duì)細(xì)菌全基因組酶切后通過(guò)脈沖場(chǎng)電泳將酶切后的分子量大小不一的DNA片段（一般大于15～20 kb）進(jìn)行分離。它的原理為：細(xì)菌包埋于瓊脂塊中，用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶在原位對(duì)整個(gè)細(xì)菌染色體進(jìn)行酶切，酶切片段在特定的電泳系統(tǒng)中通過(guò)電場(chǎng)方向不斷交替變換及合適的脈沖時(shí)間等條件下而得到良好的分離。

早在1994年P(guān)FGE技術(shù)就已經(jīng)應(yīng)用到阪崎克羅諾桿菌的分型研究中［17］。法國(guó)疾病預(yù)防控制中心的醫(yī)生從17個(gè)嬰幼兒的體內(nèi)、食用過(guò)的食物和未食用過(guò)的配方粉中分離到了克洛諾桿菌屬菌株。利用PFGE對(duì)這17株分離菌株進(jìn)行分型，經(jīng)聚類分析后分型為4個(gè)群，其中有兩個(gè)群包含的分離菌株是從患病嬰兒體內(nèi)分離得到的，其中一個(gè)群包含的分離菌株分離于癥狀輕微的嬰兒，而另一個(gè)群的分離菌株分離于意外死亡的嬰兒。第三個(gè)類型包含的分離菌株是從準(zhǔn)備的食物，一個(gè)無(wú)明顯癥狀的嬰兒和一個(gè)腸道具有輕微消化問(wèn)題的嬰兒。第四個(gè)群中含有的分離菌株全部都是從嬰幼兒配方粉中分離得到的。在這個(gè)實(shí)例中，發(fā)現(xiàn)這起食物中毒事件和嬰幼兒配方粉并沒(méi)有直接的內(nèi)在聯(lián)系，而是由準(zhǔn)備喂養(yǎng)的其他食物通過(guò)其他途徑感染阪崎克洛諾桿菌屬菌株造成的［18］。

PFGE分型的優(yōu)點(diǎn)是：特異性高，重復(fù)性好，分辨率高，結(jié)果可靠，是監(jiān)測(cè)食源性病原菌暴發(fā)流行的極其有用的手段之一，能較好地反映出受試菌的流行病學(xué)相關(guān)性，有效追查傳染源，發(fā)現(xiàn)傳播方式，及時(shí)控制疾病的暴發(fā)流行，指導(dǎo)臨床治療，快速、可靠、準(zhǔn)確地用于醫(yī)院感染暴發(fā)病原體的分子流行病學(xué)調(diào)查，是醫(yī)院感染調(diào)查最好的分型方法。其缺點(diǎn)是：技術(shù)復(fù)雜、耗時(shí)、費(fèi)用高，需要特殊的儀器設(shè)備。另外就是經(jīng)常有菌株難以進(jìn)行PFGE分型，切切不利于快速分型，這也從某種程度上消弱或限制了它的應(yīng)用。

1.3 核糖體分型

核糖體是細(xì)胞內(nèi)一種核糖核蛋白顆粒（ribonueleoprotein particle），在各類細(xì)胞中普遍存在的顆粒狀結(jié)構(gòu)，是一種非常重要的細(xì)胞器。核糖體是無(wú)膜的細(xì)胞器，主要成分是蛋白質(zhì)與RNA。核糖體RNA簡(jiǎn)稱為rRNA，約占60%，蛋白質(zhì)約占40%，蛋白質(zhì)分子主要分布在核糖體的表面，而rRNA則位于內(nèi)部，二者靠非共價(jià)鍵結(jié)合在一起。其中rRNA在細(xì)菌的長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中變化不大，這表現(xiàn)在堿基組成、堿基序列、高級(jí)結(jié)構(gòu)及功能等不同層次的保守性。如果能選擇一個(gè)相對(duì)可變且又保守的目標(biāo)序列將會(huì)有利于其廣泛開展.核糖體分型對(duì)研究環(huán)境分離菌株與感染病人之間的潛在的聯(lián)系有很大的幫助。核糖體分型是一種DNA限制性內(nèi)切酶分析與Southern雜交技術(shù)相結(jié)合的方法。它是利用Southern印跡技術(shù)來(lái)檢測(cè)含有rRNA基因的染色體區(qū)域的多態(tài)性，探針序列和標(biāo)記技術(shù)可以不同，最常用的探針序列為大腸埃希菌16S和23S rRNA片段。rRNA是細(xì)菌進(jìn)化過(guò)程中高度保守的基因，可用一個(gè)探針?lè)中驮S多細(xì)菌。阪崎克羅諾桿菌染色體DNA經(jīng)限制酶切消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，然后與細(xì)菌rRNA探針雜交，根據(jù)雜交條帶的數(shù)目和大小不同鑒別菌株。盡管它的實(shí)用性、描述能力不及PFGE和RAPD法，但當(dāng)對(duì)大量的菌株進(jìn)行評(píng)估的時(shí)候用核糖體分型往往是更好的篩選方法。有報(bào)道表明，核糖體分型作為一種新型的檢測(cè)分類方法，可以用來(lái)進(jìn)行副溶血弧菌分子流行病學(xué)調(diào)查的手段。杜邦RiboPrinter全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)已經(jīng)被成功地應(yīng)用于克羅諾桿菌屬的多態(tài)性分類鑒定。

Nazarowec-White和Farber［19］于1999年對(duì)某一家醫(yī)院11年里分離到的3株克羅諾桿菌屬分離菌株進(jìn)行了核糖體分型，發(fā)現(xiàn)他們的分型圖譜是一致的，表明環(huán)境中存在的克羅諾桿菌屬致病菌株具有高度的遺傳相似性。因此，說(shuō)明核糖體分型能夠用于區(qū)分不同來(lái)源的克羅諾桿菌屬菌株之間的相關(guān)性，是一種相對(duì)快速簡(jiǎn)便的分型方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)是分型率高，分辨力強(qiáng)，重復(fù)性好，結(jié)果判定容易，現(xiàn)在已有商品化的核糖體分型自動(dòng)系統(tǒng)。缺點(diǎn)是技術(shù)復(fù)雜，費(fèi)用較高，難以普及。另外核糖體分型由于其是基于非常保守的基因，因此，相對(duì)于其他分型方法分辨能力略低一些。

1.4 REP-PCR和ERIC-PCR

腸桿菌科基因間重復(fù)序列為引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR，ERIC-PCR）分型技術(shù)，是以腸桿菌科基因間重復(fù)序列為引物進(jìn)行PCR，能擴(kuò)增出多態(tài)性的DNA圖譜。由于這些短重復(fù)序列在菌株種屬水平上分布有差異以及進(jìn)化過(guò)程有相對(duì)保守性，通過(guò)比較DNA圖譜既可對(duì)各種微生物進(jìn)行快速分型及鑒定，又可對(duì)其進(jìn)行DNA水平上的遺傳多樣性分析。在ERIC的中心有一段保守性很高的反向重復(fù)序列，該序列長(zhǎng)約44 bp，Versalovic［20］根據(jù)這一ERIC核心序列設(shè)計(jì)了反向引物，用于擴(kuò)增兩段ERIC之間的片段，發(fā)展出了ERIC-PCR技術(shù)。同樣根據(jù)基因外重復(fù)回文系列（REP）設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增兩段REP之間的片段，發(fā)展出了REP-PCR技術(shù)。

目前，ERIC-PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)各種革蘭氏陰性菌。2008年，Proudy［21］利用ERIC-PCR、PFGE以及鞭毛基因fliC的序列測(cè)定三種分型方法分析了27株克羅諾桿菌屬臨床分離株和環(huán)境分離株。結(jié)果表明ERIC-PCR和PFGE分型的結(jié)果達(dá)到了92%的一致性，說(shuō)明ERIC-PCR方法能夠用于克羅諾桿菌屬菌株的流行病學(xué)調(diào)查的研究。單單依靠鞭毛基因fliC的序列進(jìn)行區(qū)分，其分辨率相對(duì)較低，難以滿足流行病學(xué)調(diào)查的要求。此外，Heaty［22］利用REP-PCR和PFGE同時(shí)對(duì)克羅諾桿菌屬分離菌株進(jìn)行了分子分型的比較，通過(guò)計(jì)算辛普森指數(shù)，發(fā)現(xiàn)PFGE的分辨率是0.998，而REP-PCR的分辨率是0.974，表明兩種方法之間的分辨率差別不大。盡管PFGE是致病菌株流行病學(xué)調(diào)查的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而基于PCR的分子分型方法卻更加經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便并且能夠更快的獲知結(jié)果。

1.5 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析（RAPD）

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)是建立在PCR基礎(chǔ)之上的一種可對(duì)整個(gè)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)。其以基因組DNA為模板，以單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列為引物，在熱穩(wěn)定的DNA Taq聚合酶作用下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酞胺電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測(cè)多態(tài)性。擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性。RAPD技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于生物的品種鑒定、系譜分析及進(jìn)化關(guān)系的研究上。

早在1999年，Nazarowec-White和Farber就開發(fā)了對(duì)克羅諾桿菌屬菌株進(jìn)行分子分型的方法［19］，他們采用了RAPD、核糖體分型和PFGE同時(shí)對(duì)克羅諾桿菌屬菌株進(jìn)行了分子分型。和核糖體分型，生物型以及抗菌圖譜的分型結(jié)果相比，RAPD和PFGE是分辨率最高的兩種分型方法。雖然RAPD的分型結(jié)果在不同實(shí)驗(yàn)室間變化較大，分辨力也不如PFGE技術(shù)高；但在疾病暴發(fā)流行時(shí)，RAPD仍是一種分析相關(guān)菌株和排除不相關(guān)菌株的良好技術(shù)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)便、安全、靈敏、經(jīng)濟(jì)，引物通用，不必預(yù)先知道待擴(kuò)增序列，適用于醫(yī)院感染的監(jiān)控研究、細(xì)菌遺傳學(xué)和流行病學(xué)研究及細(xì)菌基因型和各種表現(xiàn)型關(guān)系的研究。缺點(diǎn)是用單一引物分辨率低。雖然隨著引物的增加分辨率增高，但操作技術(shù)也更復(fù)雜，并易受所選擇引物、反應(yīng)控制條件（如模板質(zhì)量、Mg2+濃度、引物濃度）等因素的影響。

1.6 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）技術(shù)是基于PCR反應(yīng)的一種選擇性擴(kuò)增限制性片段的方法。由于不同物種的基因組DNA大小不同，基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，產(chǎn)生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的雙鏈接頭與酶切DNA片段連接作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，用含有選擇性堿基的引物對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，選擇性堿基的種類、數(shù)目和順序決定了擴(kuò)增片段的特殊性，只有那些限制性位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后根據(jù)凝膠上DNA指紋的有無(wú)來(lái)檢驗(yàn)多態(tài)性。

2007年，Iversen等［2］利用該技術(shù)對(duì)200余株克羅諾桿菌屬菌株進(jìn)行了分型，和DNA-DNA雜交相比，該技術(shù)具有更高的分辨率和更強(qiáng)的多態(tài)性。缺點(diǎn)是操作步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

1.7 多位點(diǎn)可變重復(fù)序列分型

多位點(diǎn)可變重復(fù)序列（Multiple-locus variable-number tandem repeats，MLVA）是一種新出現(xiàn)的分子指紋圖譜技術(shù)，已經(jīng)被應(yīng)用到大腸桿菌O157：H7和金黃色葡萄球菌等食源性致病菌的種間鑒定和分型中。其原理是根據(jù)細(xì)菌染色體上有多個(gè)較短且重復(fù)數(shù)目不同的核酸片段，不用菌株之間在不同位點(diǎn)的重復(fù)數(shù)目并不完全一致，因此可以在目標(biāo)序列兩端設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序或通過(guò)毛細(xì)管電泳分離分析，即可比較不同菌株之間的序列差異，從而可以鑒定它們的基因型是否一致。通過(guò)序列重復(fù)查找軟件trf或網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)（http://genome/wustl. edu/pub/organism/Microbes/Enteric_Bacteria/Enterobacter_sakazakii/assembly/Enterobacter_sakazakii-4.0/））即可發(fā)現(xiàn)阪崎克羅諾桿菌兩條染色體上的所有VNTR（variable-number tandem repeats），通過(guò)篩選比較即可進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。Mullane et al等［23］已經(jīng)根據(jù)該原理建立了克羅諾桿菌屬菌株的多位點(diǎn)可變重復(fù)序列分型方法，并根據(jù)該方法對(duì)搜集到的不同來(lái)源和不同表型的克羅諾桿菌屬菌株進(jìn)行了分型。

該方法的優(yōu)點(diǎn)是：簡(jiǎn)單、快速，分辨率高，重復(fù)性好，沒(méi)有先進(jìn)電泳設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室也可進(jìn)行。在相關(guān)菌株的分型中，該法比PFGE分型、噬菌體分型的分辨力更高］。MLVA技術(shù)日趨成熟，能進(jìn)行國(guó)際化比較，適合基層應(yīng)用及全球流行病學(xué)研究，有效地追蹤暴發(fā)和其他形式的細(xì)菌播散，并可進(jìn)行大樣本的檢測(cè)分析。其缺點(diǎn)是：作為帶型分型方法輸出結(jié)果有局限性，而且不方便對(duì)每個(gè)位點(diǎn)重復(fù)序列的數(shù)目進(jìn)行計(jì)。

1.8 多位點(diǎn)序列比對(duì)分型

多位點(diǎn)序列分析（Multilocus sequence typing，MLST）是一種基于看家基因序列之間的突變位點(diǎn)之間的差異進(jìn)行分型。首先選定目的基因組的數(shù)個(gè)管家基因位點(diǎn)，對(duì)各基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物，然后擴(kuò)增各自的管家基因片段。擴(kuò)增的產(chǎn)物純化后測(cè)定各位點(diǎn)片段的DNA序列，進(jìn)而給出每個(gè)基因位點(diǎn)指定相應(yīng)的等位基因數(shù)值。各管家基因位點(diǎn)的等位基因數(shù)值共同構(gòu)成一個(gè)等位基因譜，從而命名相應(yīng)的序列型。Joseph et al［24］根據(jù)7個(gè)看家基因（atpD，fusA，glnS，gltB，gyrB，infB和ppsA；全長(zhǎng)3，036 bp）分析了克羅諾桿菌屬325株菌株的多態(tài)性關(guān)系，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)阪崎克羅諾桿菌（ST4）是導(dǎo)致嬰兒腦膜炎最主要的基因型。

該方法的優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性好，二期建立了有大型數(shù)據(jù)庫(kù)的國(guó)際網(wǎng)站，可直接將試驗(yàn)結(jié)果提交數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，為食源性病原菌流行病學(xué)研究提供巨大的信息資源，并可分析菌株的遺傳相關(guān)性。此外，該法適合長(zhǎng)期大范圍的流行病學(xué)調(diào)查（如全球流行病學(xué)調(diào)查），探測(cè)菌株的起源和進(jìn)化；缺點(diǎn)是工作量大，費(fèi)用高，需要核酸測(cè)序技術(shù)，技術(shù)要求嚴(yán)格，需特殊儀器設(shè)備，不適合暴發(fā)流行的常規(guī)調(diào)查和全球流行病學(xué)水平的監(jiān)督。

2 結(jié)束語(yǔ)

克羅諾桿菌屬菌株是污染嬰幼兒配方粉的一種危害較大的食源性致病菌.運(yùn)用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法每次只能確定或排除一種病菌，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌的危急確認(rèn)；而且由于病原菌血清型和致病性不存在對(duì)應(yīng)的關(guān)系，因此單獨(dú)的血清學(xué)分型方法難以準(zhǔn)確分析菌株之間的親緣關(guān)系。因此對(duì)出現(xiàn)和暴露的污染問(wèn)題，不能進(jìn)行全面的溯源和追蹤分析，因而找不到或無(wú)法證實(shí)感染的根源，往往延誤疾病的治療和流行的控制，這也是長(zhǎng)期以來(lái)制約快速處理急性中毒事件的瓶頸和困擾衛(wèi)生監(jiān)督和防疫部門的難題所在。因此，正確鑒定、分類和追溯克羅諾桿菌屬菌株的傳染源成為當(dāng)務(wù)之急十分迫切的一項(xiàng)科研任務(wù)。分子分型方法已經(jīng)在食源性病原菌毒力菌株和流行致病菌株的鑒定和溯源方面發(fā)揮了無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，它不但可以追蹤食源性病原菌流行株的感染源，還可以快速確證不同地區(qū)不同變種之間的差異，從而能夠快速正確地確定致病菌的源頭，立即啟動(dòng)召回措施，切斷傳播途徑，從而防止危害的進(jìn)一步傳播和蔓延。

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Research progress on the molecular typing of Cronobacter spp.from powder infant formula

CHEN Wan-yi，LIU Zhen-min，REN Jing
（State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Dairy research institute，Bright Dairy&Food Co.，Ltd.，Shanghai 200436，China）

Rapid and reliable identification of strains of the genus Cronobacter is important for surveillance，prevention and control of this food-borne pathogen.Moreover，for Cronobacter a species differentiation is relevant for epidemiological studies.At present，more and more genotyping methods have been used to differentiate Cronobacter spp..This review summarizes the latest molecular typing methods for detection，identification and typing of Cronobacter spp..Therefore，we can take measures to rapidly find out the source of produce and prevent the spread of food poisoning events once powdered infant formula（PIF）is contaminated by Cronobacter spp..

Cronobacter spp；identification；molecular typing

Q935

B

1001-2230（2016）08-0043-04

2015-11-27

上海市經(jīng)委引進(jìn)技術(shù)的吸收與創(chuàng)新計(jì)劃（14XI-1-15）；科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金（2012GB2CO00141）。

陳萬(wàn)義（1975-），男，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槭称钒踩?/p>

任婧