細胞膜對釀酒酵母乙醇耐受性影響的研究進展

張苗苗，陸　棟，剡　倩，郭曉鵬，李文建*

（1.中國科學院 近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省微生物資源開發利用重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

細胞膜對釀酒酵母乙醇耐受性影響的研究進展

張苗苗1，2，陸棟1，2，剡倩1，郭曉鵬1，李文建1，2*

（1.中國科學院 近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省微生物資源開發利用重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

釀酒酵母因其發酵工藝成熟主要被用于燃料乙醇生產及釀造行業。然而發酵過程中乙醇積累對酵母細胞的毒害是限制乙醇產量的主要因素之一，乙醇積累引起的細胞膜變化是研究酵母細胞乙醇耐受性的重要方面。該文介紹了乙醇對酵母細胞膜的作用機理，以及膜脂質，膜蛋白，膜特性與乙醇耐受性之間的關系，提出了細胞膜在酵母乙醇耐受方面所起的重要作用。

釀酒酵母；細胞膜；膜脂質；膜蛋白；膜特性；乙醇耐受性

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為單細胞真核生物的代表，發酵工藝成熟，生物安全性高，主要用于燃料乙醇、白酒、葡萄酒、啤酒等的釀造生產中。細胞膜作為生物與外界環境接觸的屏障，具有維持細胞內環境穩態，確保物質正常運輸的功能。物理刺激或物質誘導會改變細胞膜脂質組成，影響膜蛋白酶活性，引起膜通透性、完整性等生理特性發生變化，從而導致細胞功能發生變化。就釀酒酵母而言，細胞膜改變與酵母細胞乙醇耐受性之間有著重要聯系。本文主要綜述了釀酒酵母細胞膜脂質組成，膜蛋白酶H+-ATPase活性及膜生理特性的變化與酵母乙醇耐受性之間的聯系，為進一步提高釀酒酵母乙醇耐受性及研究微生物細胞膜變化對其生理生化功能的影響提供基礎依據。

1　乙醇對釀酒酵母細胞膜的作用機理

一般認為，在乙醇生產過程中，不斷升高的乙醇含量會破壞酵母細胞膜的構造，導致膜通透性增加、完整性降低，最終引起胞內核酸泄露，膜蛋白酶失活，質子梯度被破壞，運輸系統崩潰，最終使酵母細胞死亡［1］。在較高乙醇含量存在環境下，酵母細胞膜脂質成分對細胞乙醇耐受性起決定性作用；并且在乙醇脅迫條件下，酵母會通過改變細胞膜脂質成分使細胞膜流動性發生改變，從而對乙醇脅迫做出應答［2-3］。酵母細胞膜脂質的主要構成成分——磷脂性脂肪酸及麥角固醇的含量被認為是解析乙醇耐受性的重要因素。脂肪酸組成水平上的改變包括：1）脂肪酸飽和度和酰基長度的調整：一些乙醇耐受性酵母菌株本身在生長過程中就可以合成較多的長鏈不飽和脂肪酸，維持膜原有流動性，增加菌體乙醇耐受性［4］；2）脂肪酸的異構化：在酵母不支持脂肪酸重新合成的情況下，脂肪酸的異構化在不涉及雙鍵易位或轉換，不需要能量輸入的情況下通過改變順、反式脂肪酸的比例對抗細胞膜通透性的增加，順式脂肪酸有彎曲的構型，與不飽和脂肪酸類似，賦予膜的流動性；反式脂肪酸有一定的剛性，可以像飽和脂肪酸一樣，插入膜的內部，增加膜的非流動性［5-6］。麥角固醇是酵母細胞固醇類中最主要的一種化合物，它能增加細胞膜的穩定性，調節細胞膜的流動性，在細胞膜上形成障礙物降低乙醇進入細胞的通透性［7］。

2　細胞膜與乙醇耐受性

細胞膜具有屏障作用，骨架為脂類雙分子層。磷脂、糖脂、固醇等是生物膜的主要脂類，它們含有親水基團（磷酸、膽堿、絲氨酸或乙醇胺等）和疏水基團（大多是脂酰基），膜蛋白結合于脂雙層中。細胞膜中的磷脂脂肪酸、糖脂、固醇及各組分的比例，膜蛋白H+-ATPase的活性，細胞膜通透性及完整性等變化均會對細胞乙醇耐受性產生重要影響。

2.1脂肪酸對酵母乙醇耐受性的影響

在培養基中加入一定量的脂肪酸，特別是不飽和脂肪酸，其可以被酵母細胞所吸收，融合到細胞膜和線粒體膜中，結果發現這些酵母細胞在乙醇發酵過程中乙醇耐受力有很大提高［8］。YOUK M等［9］通過研究不飽和脂肪酸對酵母乙醇耐受性的影響，也證實了相對于9-十六碳稀酸（C16∶1），油酸（C18∶1）融合于細胞膜后會降低細胞膜流動性，抵消乙醇對細胞膜的流化作用；在培養基中添加油酸、棕櫚酸、硬脂酸在提高乙醇耐受性的同時還會增加乙醇產量，其中硬脂酸效果最明顯［10］；在自絮凝顆粒酵母培養基中添加棕櫚酸、亞油酸或亞麻酸，發現酵母細胞膜中不但富含各自所添加的脂肪酸，并且細胞膜富含棕櫚酸的細胞具有較強的乙醇耐受性［11］，而酵母細胞培養于同時添加脂肪酸和乙醇的培養基中時，細胞乙醇耐受能力明顯提高［12］。

有些酵母細胞自身在生長過程中可以合成較多的長鏈不飽和脂肪酸，使細胞乙醇耐受性提高，CHEN S等［13］的研究結果顯示，經過乙醇耐受性傳代馴化的釀酒酵母，乙醇耐受性較高的酵母菌株脂肪酸總量無顯著變化，但是脂肪酸組成變化明顯，耐受性較高的馴化菌株細胞膜中油酸和亞油酸含量高，肉豆蔻酸含量低，并且C18/C16比例也相對較高。脂肪酸作為磷脂的非極性尾部，不管是自身生長過程中合成還是外源添加脂肪酸。融入到酵母細胞膜，均被證實可提高釀酒酵母乙醇耐受性。到目前為止，面對高濃度乙醇脅迫或乙醇對酵母細胞膜造成損傷時，酵母細胞是通過自身合成還是攝取外源脂肪酸將其融入細胞膜抵御乙醇毒害的過程還不清楚。在后續研究中，對這部分工作展開深入探討可為實際生產提供豐富的參考。

2.2膜脂質對酵母乙醇耐受性的影響

膜脂包括磷脂、鞘脂和固醇類等，除了磷脂和鞘脂脂肪酸會對酵母乙醇耐受性產生影響外，糖脂、固醇含量及其他組成基團的變化也會改變酵母細胞乙醇耐受性。

脂類變化的規律如下：1）磷脂的含量和組分方面，磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）通過影響H+-ATPase活性改變酵母細胞膜通透性。限制肌醇含量，H+-ATPase活性下降；當與肌醇合成相關的inol基因缺失時，胞內肌醇含量下降酵母乙醇耐受性降低［14］；2）糖脂的含量和組分方面，對乙醇的適應改變表現為總糖脂量上升，糖脂中的唾液酸、己糖胺含量下降，腦苷脂、硫苷脂、單葡萄糖甘油二酯含量上升；構成糖脂的糖基中葡萄糖含量升高，乳糖含量下降；當酵母處于乙醇脅迫環境下，腦苷脂和硫苷脂在膜物理結構穩定方面發揮著重要作用［15］；3）固醇的含量和組分方面，培養基中添加麥角固醇后，不但能促進酵母生長，提高乙醇產量［16］，而且當釀酒酵母細胞膜中含有豐富的麥角固醇或豆甾醇時比含有菜油甾醇或膽固醇時乙醇耐受性更強［17］，麥角固醇含量越高，菌體乙醇耐受性越強［18］。推測麥角固醇可以增加細胞膜的堅韌性，減少膜的流動性［19］。與乙醇敏感型的工業酵母菌相比，產高濃度乙醇的酵母在有氧分批培養過程中不僅能合成較多的麥角固醇，而且在應對高濃度乙醇沖擊時，死亡速率明顯慢于乙醇敏感型酵母，這說明麥角固醇與酵母耐高濃度乙醇有密切關系［20］；4）質膜各組分比例關系方面，在高滲透條件下，乙醇耐受性高的酵母細胞膜中麥角固醇/磷脂高；磷脂酰膽堿（phosphatidyl cholines，PC）/磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）高；長鏈脂肪酸比例高；不飽和脂肪酸比例略高［21］，細胞膜的這些變化均可增加菌體乙醇耐受性。

2.3膜蛋白對酵母乙醇耐受性的影響

H+-ATPase是一種重要的酵母膜蛋白，其功能是伴隨著ATP水解，參與將質子泵出質膜外，形成跨膜質子梯度，推動物質運輸。在啤酒釀造企業，H+-ATPase的活性一直作為評價酵母活力及質量的重要參數用于指導實際生產［22］。ROSEA M F等［23］比較了馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）和釀酒酵母H+-ATPase的活性，發現馬克思克魯維酵母生長于體積分數7%乙醇時與釀酒酵母生長于體積分數10%乙醇時，H+-ATPase的活性接近，均為200 nmol Pi/（min·mg），證明了H+-ATPase活性相同時，釀酒酵母的乙醇耐受性強于馬克思克魯維酵母。針對釀酒酵母的研究發現，當細胞膜H+-ATPase活性增強時，可以消減乙醇對跨膜質子流的影響［18］，提高菌體乙醇耐受性；同時也有研究表明，采用體積分數15%乙醇對絮凝酵母進行休克處理，發現H+-ATPase活性處于較高水平的絮凝酵母，乙醇耐受性也有所提高［24］。以上研究均表明，H+-ATPase活性對酵母乙醇耐受性有重要影響，而通過在培養基中添加Cu2+或者藥物處理酵母細胞，可提高H+-ATPase活性［25-26］，所以在常規的酒精生產企業或者釀酒行業均可通過提高膜H+-ATPase活性，降低乙醇濃度積累對酵母細胞的損害，提高生產效率。酵母細胞乙醇耐受性除了與H+-ATPase活性有關外，還與細胞膜中蛋白質氨基酸組成相關。HU C K等［27］研究發現，SPSC（Schizosaccharomyces pombeandSaccharomyces cerevisiae）酵母融合株生長于異亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸的混合液時，以上氨基酸組進入菌體細胞膜后會降低膜流動性，維持細胞膜穩態，提高菌體乙醇耐受性，揭示了膜蛋白質氨基酸組成與膜流動性及菌體乙醇耐受性之間的關系。

2.4膜特性對酵母細胞乙醇耐受性的影響

通透性是細胞膜的重要功能之一，是細胞與環境之間物質交換、能量轉換和信號傳導的重要保證。人為的改變細胞膜通透性，可以改變原料的輸入和代謝產物的輸出速率，主要目的是使代產物在胞外積累，使代謝朝著人們希望的方向進行，是實現代謝人工調控的重要方法之一［28］。酵母細胞膜通透性受膜脂組成和膜H+-ATPase活性的影響［29］，膜通透性的改變會影響菌體乙醇耐受性。HU CK等［30］研究發現通過向發酵培養基中添加3.5 mmol/L的Mg2+可降低自絮凝酵母融合菌株SPSC細胞膜通透性，提高菌體乙醇耐受性。酵母細胞膜通透性的大小與菌體乙醇耐受性強弱成反比關系，膜通透性越大，乙醇耐受性越弱［31］，能夠更好維持細胞膜完整性的酵母乙醇耐受性更強［32］。文中2.1也提到，細胞膜流動性的降低會降低乙醇對細胞膜的流化作用，提高菌體乙醇耐受性。

3　結語與展望

本文從脂肪酸、膜脂、膜蛋白及膜特性幾個方面總結了它們對酵母乙醇耐受性的影響作用。這幾個方面相互關聯、相互影響，如脂肪酸變化會引起膜脂變化，膜脂變化會增加或降低膜蛋白暴露于水相的部分，影響蛋白酶活性；膜脂和膜蛋白的組成和結構變化進一步決定了膜流動性、通透性、完整性的變化。所以，研究釀酒酵母細胞膜對菌體乙醇耐受性的影響已不在局限于單一方面。近年來，隨著基因組學，分子生物學，計算生物學等技術的發展，對酵母乙醇耐受性機理的研究已邁入基因表達調控，代謝通路，信號轉導甚至幾個方面的相互影響等領域，釀酒酵母乙醇耐受性的研究熱點和研究成果將不斷涌現［33］。目前，燃料乙醇作為清潔能源已開始代替有限的石化能源［34］，而酵母因其乙醇產率高和乙醇耐受性強成為燃料乙醇及釀酒行業生產中的首選微生物。在實際生產中，可根據細胞膜對釀酒酵母在葡萄酒、啤酒、乙醇發酵中產生乙醇耐受性的影響研究［35］，通過物理誘變選育，培養條件優化，生產原料改良等技術方法顯著提高酵母乙醇耐受性，提高生產效率，推動釀酒行業和燃料乙醇生產企業的發展。

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Research progress on effect of cell membrane on ethanol tolerance ofSaccharomyces cerevisiae

ZHANG Miaomiao1，2，LU Dong1，2，YAN Qian1，GUO Xiaopeng1，LI Wenjian1，2*
（1.Institute of Modern Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China；2.Key Laboratory of Microbial Resources Exploition and Application，Lanzhou 730070，China）

Saccharomyces cerevisiaewas mainly used in fuel ethanol production and brewing industry for its mature fermentation technology.However，the toxic of ethanol accumulation onS.cerevisiaecell was one of the main factors limiting ethanol yield during fermentation process，and cell membrane change caused by ethanol accumulation was an important research aspect of ethanol tolerance of yeast cells.The paper introduced the action mechanism of yeast on ethanol，the relationship between cell membrane lipids，membrane protein，membrane properties and ethanol tolerance，and the important role that cell membrane on ethanol tolerance was put forward.

Saccharomyces cerevisiae；cell membrane；membrane lipids；membrane protein；membrane properties；ethanol tolerance

Q93-3

0254-5071（2016）09-0016-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.004

2016-03-08

中國科學院科技服務網絡計劃（STS計劃）項目（KFJ-EW-STS-086）

張苗苗（1986-），女，助理研究員，碩士，研究方向微生物輻照育種與輻射生物學。

李文建（1959-），男，研究員，博士，研究方向生物物理學。