結核分枝桿菌抗體檢測試劑注冊申報資料相關問題探討

劉容枝

國家食品藥品監督管理總局醫療器械技術審評中心，北京市，100044

結核分枝桿菌抗體檢測試劑注冊申報資料相關問題探討

【作者】劉容枝

國家食品藥品監督管理總局醫療器械技術審評中心，北京市，100044

結核分枝桿菌抗體檢測試劑是結核病輔助診斷的重要手段之一，其檢測的準確性至關重要。該文就結核分枝桿菌抗體檢測試劑注冊申報的三項重要的技術資料(主要原材料研究資料、分析性能評估資料和臨床試驗資料)中的重點問題進行探討，以供申報者參考。

結核分枝桿菌抗體檢測試劑；主要原材料研究資料；分析性能評估資料；臨床試驗資料

0 引言

結核病是影響人類健康的主要傳染病之一，特別是在發展中國家，其發病率和死亡率一直居高不下。據報告，我國現有結核病患者約450萬例，每年死亡近13萬例。結核病的實驗室診斷主要依賴痰涂片抗酸染色和培養法，結核血清學檢測試劑和核酸檢測試劑是結核病輔助診斷的重要手段。結核分枝桿菌抗體檢測是結核血清學檢測中非常重要的組成部分，可提高涂片陰性結核病的檢出率以及進行鑒別診斷，因此，其檢測的準確性（敏感性和特異性）至關重要。

結核分枝桿菌抗體檢測試劑是指利用免疫學方法（如：酶免疫技術和膠體金等分析技術），對人體血清或血漿等樣本中的結核分枝桿菌抗體進行體外定性檢測的試劑，可用于結核病的輔助診斷。結核分枝桿菌抗體檢測試劑，主要指結核分枝桿菌IgG和IgM抗體檢測試劑。目前，國家食品藥品監督管理總局批準的結核分枝桿菌抗體檢測試劑主要為IgG或IgM定性檢測試劑。

1 主要原材料研究資料

主要原材料選擇的合理與否，直接關系到申報試劑的性能。因此，申請人應對市場進行充分調研后進行嚴格篩選，通過試驗驗證、選出適合自己研發平臺的原材料。對于結核分枝桿菌抗體檢測試劑而言，最重要的主要原材料是抗原。

抗原的制備主要包括兩種方式：一種是從病原體中提取目標抗原；一種是采用基因工程技術制備重組抗原。隨著分子生物學技術的日趨成熟，基因工程抗原的獲取越來越方便，成本也越來越低；而且，與傳統的病原體制備而來的抗原相比，基因工程抗原的純度相對較高、抗原表位和片段大小的選擇也相對靈活。對于酶標板等抗原包被表面積較小的固相載體而言，抗原越小，意味著可包被的有效抗原表位的絕對數量越多，試劑的靈敏度會提高。而且，許多生產廠家自身就具備生產基因工程重組抗原的技術平臺。因此，近些年來，基因工程重組抗原頗受體外診斷試劑生產廠家的青睞。

但是，大部分的基因工程重組抗原來源于大腸桿菌原核表達系統，缺少糖基化等真核細胞中特有的蛋白后修飾過程，因此，與寄生在人體細胞中的、采用人體細胞真核表達系統進行蛋白表達修飾的結核分枝桿菌抗原相比，存在一定的差異。另外，大腸桿菌表達系統除了產生目標抗原外，還包括許多自身的其他蛋白，盡管經過多種方法分離純化后，得到的目標抗原的純度較高，生產廠家仍需要考慮大腸桿菌表達系統可能引入的非特異性反應。因此，申請人需廣泛選擇抗原，并采用臨床血清或血漿樣本進行試驗，篩選與真實的臨床樣本反應性且特異性好的抗原。

一般采用企業參考品來篩選抗原。企業參考品的制備，則常采用已上市的至少2家同類試劑檢測臨床血清或血漿樣本，選擇幾種試劑同時檢測為陰性或陽性的臨床血清或血漿樣本，作為企業陰性參考品或陽性參考品。陽性參考品應包括臨界陽性樣本、中等濃度陽性樣本以及高濃度陽性樣本，覆蓋臨床可能出現的各種程度的樣本，便于選出具有高靈敏度的抗原；同時，陰性參考品應包括可能產生交叉反應的其他病原體抗體陽性的血清或血漿樣本，便于選出具有高特異性的抗原。除此之外，還需選擇合適抗體滴度的臨床陽性樣本作為精密度參考品，以便考核備選抗原的穩定性。

申請人在提交此部分資料時，需詳細描述抗原選擇過程的各種研究資料以及驗證資料。

2 分析性能評估資料

2.1 最低檢出限

已獲批準的結核分枝桿菌抗體檢測試劑均為定性檢測試劑，目前尚無結核分枝桿菌抗體定量檢測試劑獲準上市。因此，對于該類試劑的最低檢出限，無法給出絕對濃度。為了確定該類試劑的最低檢出限，一般選取經其他已上市的同類試劑確認為陽性的、特定滴度的結核分枝桿菌抗體樣本，做系列倍比稀釋后進行檢測，將檢測結果陽性率在90%以上（n≥20）的最大稀釋倍數作為申報試劑的最低檢出限。

2.2 分析特異性

影響申報試劑特異性的因素主要包括：抗原結構相近或臨床癥狀相似的其他病原體的抗體可能帶來的交叉反應；以及臨床樣本本身含有的干擾物質和抗凝劑（血漿）可能帶來的干擾。

2.2.1 交叉反應

研究抗原結構相近或臨床癥狀相似的其他病原體的抗體對結核分枝桿菌抗體檢測試劑是否存在交叉反應。用于交叉反應研究的其他病原體包括但不限于：弓形蟲、風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒、E-B病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒、肺炎支原體、人類免疫缺陷病毒、肺炎鏈球菌等。一般采用已經上市的試劑篩選其他病原體抗體陽性、而結核分枝桿菌抗體陰性的臨床樣本，然后采用申報試劑檢測這些臨床樣本，如申報試劑的檢測結果為陰性，說明其他病原體的抗體對申報試劑無交叉。

申請人需提交用于交叉反應驗證的病原體的來源、濃度或滴度確認等信息。

2.2.2 干擾實驗

(1) 內源性物質的干擾

需研究樣本中常見的內源性干擾物質（總IgG、總IgM、膽紅素、血紅蛋白、甘油三酯、系統性紅斑狼瘡、抗核抗體、類風濕因子等）對結核分枝桿菌抗體檢測試劑的干擾情況。常用方法為：采用申報試劑檢測結核分枝桿菌抗體陰性的、含有不同濃度干擾物質的臨床樣本，以及結核分枝桿菌抗體弱陽性的（臨界濃度)、含有不同濃度干擾物質的臨床樣本，研究不同濃度的干擾物質對申報試劑檢測結果的影響，確定不影響檢測結果的干擾物質的最高濃度。

(2) 抗凝劑的干擾

如果結核分枝桿菌抗體檢測試劑可用于血漿樣本的檢測，需采用各種適用抗凝劑抗凝的血漿樣本分別與血清樣本進行比對實驗研究。常用方法為：檢測至少50例同源的結核分枝桿菌抗體陰性、弱陽性（略高于臨界值）的血清和血漿樣本（不同抗凝劑各50例），并計算陰性符合率和陽性符合率，進行定性試劑的統計分析，驗證申報試劑對于血清和血漿樣本檢測結果的一致性。

對于結核分枝桿菌IgM抗體檢測試劑而言，還需對至少10份含有結核分枝桿菌IgM抗體的樣本進行IgM破壞研究實驗。常用方法為：采用特定的化學制劑（如2－巰基乙醇或二硫蘇糖醇）處理含有結核分枝桿菌IgM抗體的臨床樣本，破壞結核分枝桿菌IgM抗體的結構后，重新進行檢測，申報試劑的檢測結果應為陰性。

2.3 精密度

精密度試驗無約定方法，申請人可根據自身的研發平臺確定科學合理的方法。申請人可參考國內或國外的相關文件進行精密度研究。需對每項精密度指標的評價標準做出合理的要求，如標準差或變異系數的范圍等。結核分枝桿菌抗體的精密度評價主要包括以下要求。

(1)驗證申報試劑檢測過程中的主要變量（如：申報試劑本身、配套的適用機型、操作者、地點等要素）對精密度的影響。

(2)設定合理的周期進行精密度評價。例如：進行至少20 d的檢測，每天至少由3人完成不少于3次的檢測，以便對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行評價。

(3)采用至少以下3個水平的臨床樣本進行精密度的評價：陰性樣本：結核分枝桿菌抗體濃度低于申報試劑臨界值的臨床樣本；弱陽性樣本：結核分枝桿菌抗體濃度略高于申報試劑臨界值的臨床樣本；陽性樣本：結核分枝桿菌抗體濃度呈中到強陽性的臨床樣本。

2.4 鉤狀（HOOK）效應

對于采用一步法免疫學原理的結核分枝桿菌抗體試劑(比如膠體金法等)，還需研究申報試劑對含有高濃度結核分枝桿菌抗體的臨床樣本的檢測能力。常用方法為：系列稀釋含有高濃度結核分枝桿菌抗體的臨床樣本，然后由低濃度至高濃度進行檢測，每個稀釋度的樣本重復檢測3～5次，考查申報試劑是否對高濃度陽性樣本檢出陰性。

3 臨床試驗資料

3.1 臨床試驗機構的選擇

應當選定不少于3家（含3家）獲得國家食品藥品監督管理總局資質認可的臨床試驗機構進行臨床試驗。臨床試驗機構必須具備與申報試劑相適應的專業技術人員及儀器設備，并且能夠確保該項試驗的實施。建議申請人選擇結核病專科醫院進行臨床試驗，同時考慮臨床試驗機構的地域性，以保證臨床樣本獲取的充足性、臨床數據的可溯性以及臨床樣本選取的多樣性和代表性。

3.2 對比試劑的選擇

目前，已有多種結核分枝桿菌抗體檢測試劑獲準上市。申請人可選擇境內已批準上市的、臨床普遍認為質量較好的同類試劑作為對比試劑進行比對研究，證明申報試劑與已上市產品等效或優于已上市產品。由于不同企業的結核分枝桿菌抗體檢測試劑包被的抗原可能存在較大差異，建議申請人在進行臨床試驗前進行預實驗，以便從多種已上市試劑中選擇性能相近同時質量較好的對比試劑進行臨床試驗。

對于結核分枝桿菌IgM抗體檢測試劑而言，申請人還需采用申報試劑檢測不少于30例感染急性期患者的樣本。確定感染急性期的方法包括：病原體分離培養鑒定方法、病原體IgG抗體血清學轉換（動態監測2份或以上的血清IgG，恢復期與急性期比較IgG呈4倍以上升高）、病原體核酸檢測或直接抗原檢測等方法。提醒注意的是，應密切結合患者的臨床診斷綜合判斷病例是否處于病原體感染的急性期。

3.3 臨床試驗樣本的選擇

臨床試驗對象的選擇需滿足如下條件：（1）具有結核病癥狀/體征的疑似結核患者病例；（2）結核病的病例需包括一定數量的肺結核和肺外結核病例，并含有適當數量的涂片陰性的結核病病例，病例的選擇應滿足臨床流行病學的分布特點；（3）應包括其他易混淆疾病的病例（比如肺癌、肺炎等），以對申報試劑的特異性進行評價。

3.4 適用樣本類型同時包括血清血漿的相關要求

如果申報試劑同時適用于血清和血漿兩種樣本類型，還應對至少200例的樣本進行血清血漿樣本的同源比對研究。

3.5 臨床原始數據的相關要求

最終納入統計的所有病例的臨床背景信息（臨床診斷、年齡、性別等）都應清晰并具有可追溯性。臨床原始數據表應包括臨床診斷信息，臨床診斷必須是最終的臨床確診結果，而不是進行簡單癥狀的描述。

結核病的臨床確診非常復雜，抗體檢測試劑作為有力的輔助診斷手段，其檢測的準確性至關重要。申請人在研發此類試劑時，在進行抗原等原材料的篩選時，就應充分考慮這些原材料對產品性能的影響（敏感性和特異性），并在分析性能評估和臨床試驗中對其敏感性和特異性進行充分的驗證。

[1] 黃勝, 余繼英, 趙春艷, 等. 膠體金法檢測結核抗體的臨床價值探討[J]. 臨床肺科雜志, 2014, 19(6): 1058-1060.

[2] 劉倩穎, 王心靜, 林明貴. 血清結核桿菌抗體檢測在結核病的臨床意義[J]. 中國實驗診斷學, 2014, 18(7): 1105-1107.

[3] 劉偉. 結核抗體檢測對結核疾病的臨床診斷價值探討[J]. 中國臨床新醫學, 2015, 8(1): 51-53.

[4] 孟蘇凱, 吳振萍, 張玉華, 等. 血清結核抗體檢測在結核病臨床診斷中的價值[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2015, 25(22): 3858-3860.

[5] 國家食品藥品監督管理總局令第5號）體外診斷試劑注冊管理辦法[R]. 2014-07-30.

[6] CDRH, FDA, USA. Establishing the performance characteristics of in vitro diagnostic devices for the detection or detection and differentiation of influenza viruses[R]. 2008-02-15.

[7] 國家食品藥品監督管理總局2014年第16號 體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則[R]. 2014-09-11.

Study on the Related lssues of the Registration Declaration Information of Mycobacterium Tuberculosis Antibody Detection Kit

【Writer】LIU Rongzhi

Center for Medical Device Evaluation, China Food and Drug Administration(CFDA), Beijing, 100044

Mycobacterium tuberculosis antibody detection kits are used as one important mean of auxiliary diagnosis of tuberculosis, and their detection accuracy is of great concern. Here，we discussed three important technical data of Mycobacterium tuberculosis antibody detection kits registration declaration information (main raw material research, performance evaluation data and clinical test data) , to provide reference for registrants.

Mycobacterium tuberculosis antibody detection kits, main raw material research data, performance evaluation data, clinical test data

F203

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2016.04.012

1671-7104(2016)04-0279-03

2015-02-04

劉容枝，E-mail: liurz@cmde.org.cn