應用ITS2序列對八角茴香及其混偽品的分子鑒定研究

劉 鏞 李斯璐 林 好

1廣東醫科大學藥學院 廣東省東莞市 523808 2廣東天然藥物研究與開發重點實驗室 廣東省湛江市 524023

3廣東醫科大學基礎醫學院 廣東省東莞市 523808 4廣州中醫藥大學中藥學院 廣東省廣州市 510006

應用ITS2序列對八角茴香及其混偽品的分子鑒定研究

劉 鏞1,2李斯璐3林 好4

1廣東醫科大學藥學院 廣東省東莞市 523808 2廣東天然藥物研究與開發重點實驗室 廣東省湛江市 524023

3廣東醫科大學基礎醫學院 廣東省東莞市 523808 4廣州中醫藥大學中藥學院 廣東省廣州市 510006

目的：對中藥材八角茴香及其混偽品進行分子鑒定，為控制藥材質量和指導臨床合理用藥提供科學依據。方法：通過從GenBank數據庫下載中藥材八角茴香與其混偽品的DNA條形碼ITS2序列，利用MEGA6.06軟件進行種內、種間遺傳距離分析并構建系統發育樹，應用ITS2數據庫網站預測其ITS2二級結構。結果：八角茴香與其混偽品的ITS2序列間存在明顯差異，基于ITS2序列的NJ樹及其ITS2二級結構均可以將八角茴香與其混偽品明顯區分。結論：ITS2作為DNA條形碼序列能夠有效的鑒別八角茴香及其易混偽品。

八角茴香；DNA條形碼；混偽品；ITS2序列；分子鑒定

八角茴香為雙子葉植物藥木蘭科八角茴香（Illicium Verum）的干燥成熟果實，別名大茴香、廣茴香、大料，性辛、溫，具有溫陽散寒、理氣止痛、健胃止咳的功效[1]。近年來，市場上發現有用莽草（Illicium lanceolatum）、大八角（Illicium majus）、平滑葉八角（Illicium leiophyllum）、厚皮香八角（Illicium ternstroemioides）、紅茴香（Illicium henryi）、紅花八角（Illicium dunnianum）、野八角（Illicium simonsii）、地楓皮果實（Illicium difengpi）等偽品冒充正品八角茴香使用。而八角茴香的鑒定方法主要是從基原、性狀、顯微、理化等方面進行鑒別[2]，這些傳統的鑒定方法對操作人員的專業知識要求較高，存在主觀性強、穩定性與重復性較差等方面的不足，不能夠快速準確地鑒別八角茴香及其混偽品，難以滿足中醫藥現代化發展的要求。因此，亟需建立一種簡單、快速、準確的鑒定中藥材八角茴香及其混偽品的方法。

DNA條形碼（DNA barcoding）技術是分子鑒定技術的最新進展，它是指用標準的、短的DNA片段作為物種標記而建立的一種新的生物物種鑒定方法，由加拿大動物學家、皇家學會會員Paul Hebert于2003年首先提出[3]。隨著分子生物學以及生物信息學的快速發展，應用DNA條形碼技術對物種進行鑒定已逐漸成為中藥材分類學的研究熱點[4]。其中，作為分子系統進化研究中最重要的標記之一，ITS2（internal transcribed spacer 2, ITS2）已被提出作為藥用植物鑒定的標準條形碼序列。然而，利用ITS2對八角茴香的相關鑒定研究尚未發現有專門報道。本研究利用ITS2序列對八角茴香及其混偽品進行分子鑒定，為八角茴香的快速準確鑒定及其開發利用和安全用藥提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

本實驗所用材料包括八角茴香及其混偽品莽草、大八角、平滑葉八角、厚皮香八角、紅茴香、紅花八角、野八角、地楓皮果實共9個品種20份樣品，所用的ITS2系列來自Genbank下載，并且經NCBI-Blast比對確認為正確序列。

1.2 數據分析

用MEGA6.06軟件基于Kimura twoparameter（K2P）模型分析種內、種間遺傳距離，并構建系統鄰接樹 (Neighbor-Joining tree，NJ Tree)，并利用Bootstrap法[5]（1000次重復）檢驗各分枝的支持率，對八角茴香及其同科屬植物進行鑒定分析。用Schultz等人的研究方法（http//its2. bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/cgibin/index.pl）預測各物種ITS2的二級結構[6]。

2 結果與分析

2.1 八角茴香及其混偽品種內及種間差異分析

利用MEGA6.06軟件計算八角茴香及其混偽品種內遺傳距離和種間遺傳距離，可以得到基于K2P模型的遺傳距離（詳見表1），計算結果顯示八角茴香與其他混偽品的種間最小遺傳距離均明顯大于八角茴香的種內最大遺傳距離，表明K2P遺傳距離可以鑒別八角茴香及其混偽品。

表 1：八角茴香種內及其與混偽品種間K2P距離

2.2 八角茴香與其混偽品ITS2序列的二級結構分析

由圖1可知，八角茴香及其混偽品的ITS2序列二級結構臂夾角幾乎類同，但是臂的長度、莖環大小、莖環數目以及環與環之間的距離均有差異。

2.3 NJ樹聚類分析

基于ITS2序列構建的八角茴香及其混偽品的NJ系統發育樹（圖2）中可以看出，八角茴香獨立聚為一枝，與其它易混品可明顯區分（支持率均大于50%）。

3 討論

圖1：八角茴香及其混偽品藥用植物ITS2序列的二級結構比較

圖2：基于ITS2序列構建的八角茴香與其混偽品的NJ樹

DNA條形碼技術在物種鑒定以及相關領域的應用研究已成為現代生物學最活躍的研究領域和新的熱點問題之一，也是未來物種鑒定的發展趨勢[7]。陳士林課題組在國內率先提出將DNA條形碼技術用于中藥材的鑒定，并建立了藥用植物DNA條形碼鑒定策略及關鍵技術分析[8]?；贗TS2的DNA條形碼技術為中藥材的快速準確鑒定提供了誘人的前景，受到越來越多學者的關注[9]。

八角茴香中藥材在臨床與養生應用十分廣泛，但市場上八角茴香的混偽品多而混雜。本研究基于ITS2條形碼序列研究八角茴香及其混偽品的種內、種間遺傳距離，構建系統發育樹以及分析ITS2序列的二級結構圖，能夠準確區分八角茴香及其混偽品。因此，作為DNA條形碼的ITS2序列為準確、簡便地鑒定八角茴香及其混偽品提供了新的分子鑒定方法，為控制藥材質量穩定和指導臨床合理用藥及中藥材的開發利用提供了科學依據。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版一部[M].北京:中國醫藥科技出版社,2015:4-5.

[2]李峰,宋曉玲,劉亞魯.八角茴香及其混偽品的鑒別[J].山東中醫雜志, 2011,30(10):739-740.

[3]Hebert,P D,Cywinska A,Ball S L, et al,Biological identifications through DNA barcodes[J].Proc Biol Sci,2003,270(1512):313-321.

[4]向婷婷,周志勇,劉朝奇,等.DNA條形碼鑒定藥用植物的研究進展[J].時珍國醫國藥,2015,26(01):181-183.

[5]Tamura K,Nei M,Kumar S.Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighborjoining method[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(30):11030-11035.

[6]Schultz J,Muller T,Achtziger M, et al.The internal transcribed spacer 2 database--a web server for(not only)low level phylogenetic analyses[J].Nucleic Acids Res,2006,34(Web Server issue):W704-707.

[7]陳士林,龐曉慧,羅焜,等.生物資源的DNA條形碼技術[J].生命科學, 2013,25(05):451-459.

[8]陳士林,宋經元,姚輝,等.藥用植物DNA條形碼鑒定策略及關鍵技術分析[J].中國天然藥物,2009,7(05):322-327.

[9]陳珂蕊,何震宇.DNA條形碼技術在中藥領域的應用進展[J].中華中醫藥雜志,2016,31(01):208-210.

劉鏞（1982-），男，廣東省茂名市人。碩士學位?，F為廣東醫科大學講師。研究方向為中藥分子鑒定和分子藥理學。

林好（1992-），男，廣東省梅州市人?，F為廣州中醫藥大學研究生在讀學生。研究方向為中藥分子鑒定。

李斯璐（1983-），女，廣東省韶關市人。碩士研究生學歷?，F為廣東醫科大學講師。研究方向為基礎醫學。